【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体及其制备方法，属于基因工程和酶工程领域。
技术介绍
1、木聚糖是自然界中含量第二丰富的多糖，仅次于纤维素。不同来源的木聚糖在组成和结构上存在较大差异。天然的木聚糖主链由β-1，4-吡喃型d-木糖构成，同时也可被阿拉伯糖、香豆酸等糖和有机酸所取代。木聚糖的支链取代基的化学组成通常与其来源有关，如o-乙酰基、α-l-呋喃阿拉伯糖基、α-d-吡喃葡萄糖醛酸基等。其支链取代基可进一步与阿魏酸，木质素等连接，形成更加复杂的结构。因此，针对木聚糖的降解，往往需要一系列具有不同特异性的水解酶，如木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-l-阿拉伯糖苷酶等。
2、木聚糖酶endo-1,4-β-xylanase(ec 3.2.1.8)，属于糖苷水解酶(gh)家族，催化β-1-4-糖苷键，实现主链骨架的降解形成低聚糖，在降解木聚糖中发挥主要作用。目前，大多数针对木聚糖酶的研究主要集中于gh10和gh11家族木聚糖酶，gh10木聚糖酶具有(α/β)8桶状结果，能有效降解预处理生物质，在工业和生物
有巨大的潜力。
3、在诸多工业领域如造纸和饲料工业，纺织过程中，碱性耐热木聚糖酶都有着重要的应用。环境中的碱处理和高温条件对木聚糖酶的催化活性和耐热性都具有较高要求，专利cn201010256129.0提供了一种耐高温耐碱的木聚糖酶，可应用于纸浆漂白等领域，而更高的漂白温度有利于加快反应速率，提高漂白效率，一般而言，温度每提高7℃，漂白的速度加快1倍。因此，提供一种高比酶活和极端温度下稳
技术实现思路
1、为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体及其制备方法，有利于其在工业领域的诸多应用。
2、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
3、本专利技术通过半理性设计的方法，对来源于bacillus halodurans的耐热耐碱木聚糖酶(氨基酸序列seq id no：1，核苷酸序列seq id no：2)进行改造，得到比酶活和稳定性提高的突变体。本专利技术还提供了包含上述突变体基因的重组载体和重组工程菌。
4、因此，本专利技术的第一个目的是提供一种比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体，其氨基酸序列如seq id no：3所示。其是将seq id no：1所示的碱性木聚糖酶的第96位组氨酸(h)突变为天冬酰胺(n)，第145位谷氨酸(e)突变为异亮氨酸(i)，第168位缬氨酸(v)突变为丙氨酸(a)获得。该突变体命名为m22。
5、本专利技术的第二个目的是提供编码该碱性木聚糖酶突变体的基因。
6、在本专利技术的一种实施方式中，编码上述碱性木聚糖酶突变体的基因的核苷酸序列如seq id no：4所示。
7、本专利技术的第三个目的是提供含有上述基因的表达盒、重组载体。
8、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组载体的出发载体包括但不限于pet系列的载体或ppiczα载体；优选为pet-28a(+)载体或ppiczαa载体。
9、本专利技术的第四个目的是提供一种表达所述木聚糖酶突变体的重组工程菌。
10、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组工程菌的宿主菌为细菌、真菌等；所述细菌包括埃希氏菌属(escherichia)等细菌；所述真菌包括毕赤酵母等酵母。
11、优选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述重组工程菌以e.coli bl21(de3)为宿主。
12、优选的，在本专利技术的一种实施方式中，宿主细胞为毕赤酵母(pichia pastoris)。
13、本专利技术的第五个目的是提供一种增强碱性木聚糖酶比酶活和热稳定性的方法，是将木聚糖酶的第96位组氨酸(h)突变为天冬酰胺(n)，第145位谷氨酸(e)突变为异亮氨酸(i)，第168位缬氨酸(v)突变为丙氨酸(a)。
14、本专利技术的第六个目的是提供一种获得所述碱性木聚糖酶突变体的方法。
15、在本专利技术的一种实施方式中，通过设计含有突变位点的引物对编码氨基酸序列如seq id no：1所示的碱性木聚糖酶的基因进行定点突变后表达，得到比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体。
16、进一步的，设计含有突变位点的引物向编码氨基酸序列如seq id no：1所示的碱性木聚糖酶的基因中引入突变，经测序正确后转入大肠杆菌bl21(de3)中进行表达，得到比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体。
17、更进一步的，将经菌落pcr验证正确后的基因工程菌的单克隆接种到终浓度50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃摇床，200rpm培养12～16h，获得种子液。以初始od600＝0.1的接种量将种子液转接至含有终浓度50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，于37℃摇床，200rpm培养至od600＝0.6～0.8，加入终浓度为0.4mmol/l的iptg，在16℃，200rpm摇床中培养16h进行诱导表达。
18、本专利技术的第七个目的是提供所述碱性木聚糖酶突变体、编码基因、表达盒、重组载体或重组工程菌在制备比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体中的应用。
19、本专利技术的第八个目的是提供所述碱性木聚糖酶突变体、编码基因、表达盒、重组载体或重组工程菌在生物质资源利用，食品或制药领域中的应用。
20、本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：
21、本专利技术通过半理性设计的方法提供了碱性木聚糖酶突变体m22，其比酶活为211u/mg，相比于野生型提高了181.33％。75℃热处理30min后，突变体m22相对于野生型的残余活性为169.30％；相对于75℃下处理30min的野生型，80℃、85℃、90℃处理后，m22的相对残余活性分别为153.94％、127.84％、115.02％。本专利技术获得的碱性木聚糖酶突变体m22与野生型相比，比酶活和稳定性得到显著提高，在工业生产中具有更高的应用价值和潜力。
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1.一种比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.编码权利要求1所述的比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：
4.权利要求1所述的比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体相关的生物材料，其特征在于，为下述生物材料中的任意一种或多种组合：
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：
6.权利要求1所述的比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体、权利要求2～3任一项所述基因或权利要求4～5任一项所述生物材料在制备比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体中的应用。
7.权利要求1所述的比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体、权利要求2～3任一项所述基因或权利要求4～5任一项所述生物材料在生物质资源利用，食品或制药领域中的应用。
8.一种增强碱性木聚糖酶比酶活和热稳定性的方法，其特征在于，是将SEQ ID NO：1所示的碱性木聚糖酶的第96位组氨酸突变为天冬酰胺，第145位谷氨酸突变为异亮
9.一种获得权利要求1所述比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：通过设计含有突变位点的引物对编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的碱性木聚糖酶的基因进行定点突变后表达，得到权利要求1所述比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：设计含有突变位点的引物向编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的碱性木聚糖酶的基因中引入突变，经测序正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，得到权利要求1所述比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体。
...【技术特征摘要】
1.一种比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列如seq id no：3所示。
2.编码权利要求1所述的比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：
4.权利要求1所述的比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体相关的生物材料，其特征在于，为下述生物材料中的任意一种或多种组合：
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：
6.权利要求1所述的比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体、权利要求2～3任一项所述基因或权利要求4～5任一项所述生物材料在制备比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体中的应用。
7.权利要求1所述的比酶活和热稳定提高的碱性木聚糖酶突变体、权利要求2～3任一项所述基因或权利要求4～5任一项所述生物材料在生物质资源利...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩双艳，李治萱，张智慧，葛超越，李映辰，余昊晖，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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