【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种在转基因甘薯中合成甜菜红素的分子育种方法及其应用，属于基因工程。
技术介绍
1、甜菜素是世界上广泛使用的一种水溶性含氮天然色素，因最早发现于甜菜（ beta vulgaris）根中而得名。甜菜素由红紫色的甜菜红素和黄橙色的甜菜黄素两类化合物组成，这些化合物由一系列酶催化步骤合成，包括羟基酶、双加氧酶和葡萄糖基转移酶等。甜菜、火龙果、仙人掌果等植物呈现的鲜红色即为甜菜素积累的结果。甜菜素无毒副作用，且研究发现其生理活性高，有抗菌、抗氧化、抗疲劳、预防癌症等显著功效。鉴于其安全性和对人体有诸多益处，甜菜素是唯一允许用于食物中甜菜素添加剂的来源，既增加了食品的外观又提高了其营养价值，在功能食品、化妆品和药品等众多领域有显著应用价值，因而其需求量显著增加。长期以来，甜菜素的主要来源是红甜菜根，但甜菜根提取物中含大量硝酸盐等许多因素明显限制了甜菜源甜菜素的开发与利用。目前来自甜菜的甜菜素仅能满足全球食品添加剂需求的10%。因此，研究甜菜素的生物合成过程，提高其产能，对甜菜素的开发应用具有显著价值。
2、甘薯（ ipomoea batatas）富含膳食纤维、酚类化合物、类胡萝卜素、维生素等众多对人体有益的物质。世界卫生组织尊其为最佳食品榜首，其营养指数最高。甘薯独具超高产能力、广泛的适应性等特点，它不仅可以作为粮食、饲料和工业原料，同时还是重要的新兴能源作物和高效保健作物。然而，甘薯中并没有甜菜素合成途径
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足而提供一种在转基因甘薯中合成甜菜红素的分子育种方法及其应用。
2、本专利技术在甘薯表达产生甜菜红素的基因组合及其应用，是在增强型植物超表达载体pcambia1300-eygfpuv-flag-myc的 kpni和 spei酶切位点之间连入组合基因 cyp76ad1- 2a-doda-2a-gt ( ruby)，构建其重组超表达载体，再基于发根农杆菌的原位转化技术，将重组超表达载体转入甘薯基因组中，筛选获得块根富含甜菜红素并呈粉红色的转基因甘薯材料。该转基因甘薯植株不仅可以作为生产甜菜红素的优秀原料，而且还可以成为促进健康的功能性甘薯新品种。
3、本专利技术的目的之一在于，提供一种甜菜红素生物合成组合基因 ruby，由 cyp76ad1（p450 oxygenase）基因、 doda（l-dopa 4,5-dioxygenase）基因和 gt（betanidin-5-o-glucosyltransferase）基因通过编码可自行切割的2a肽序列依次串联组成，所述 cyp76ad1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述 doda 基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述 gt基因的核苷酸序列如seq id no.5所示，2a肽基因1的序列如seq id no.2所示，2a肽基因2的序列如seq id no.4所示。 ruby基因的核苷酸序列组成顺序为 cyp76ad1- 2a- doda- 2a- gt，如seq id no.1-seq id no.5所示。
4、本专利技术研究发现，参与甜菜红素积累的组合基因 ruby，将其异源表达于甘薯植株中，可显著地提高甜菜红素的积累，对于通过基因工程技术定向培育富含甜菜红素的转基因甘薯新品种具有重要意义。
5、本专利技术的目的之二在于，提供含有参与甜菜红素合成的组合基因 ruby的增强型重组表达载体。
6、上述的增强型重组表达载体，包括分别与2×35s启动子（含cor47-5′utr翻译起始增强子序列）和hsp-t878终止子融合的 ruby基因的表达盒。
7、上述的增强型重组表达载体，是在pcambia1300-eygfpuv-flag-myc载体的 kpni和 spei酶切位点之间连入甜菜红素生物合成组合基因 ruby的核苷酸序列。
8、本专利技术的目的之三在于，提供含有如上述增强型重组表达载体的微生物转化体。
9、上述的微生物转化体为发根农杆菌k599。
10、本专利技术的目的之四在于，提供上述甜菜红素生物合成组合基因 ruby在制备转基因甘薯中的应用。
11、进一步的，本专利技术提供上述甜菜红素生物合成组合基因 ruby在甘薯合成甜菜红素中的应用。
12、本专利技术参与甜菜红素生物合成的组合基因 ruby能够提高甘薯中甜菜红素的合成。将参与甜菜红素生物合成的组合基因 ruby转入甘薯基因组中，在转基因甘薯中过表达，得到高甜菜红素含量的转基因甘薯。
13、一种在转基因甘薯中合成甜菜红素的分子育种方法，所述转基因材料的构建方法为：组合共表达甜菜红素合成的三个关键基因，包括 cyp76ad1基因、 doda基因和 gt基因，三个基因通过编码可自行切割的2a肽序列依次串联而偶联至一个开放阅读框中，称为 ruby基因，构建其增强型重组超表达载体，转入发根农杆菌并遗传转化甘薯植株，获得富含甜菜红素的转基因甘薯。
14、上述的分子育种方法，其特征在于，所述甘薯材料为烟薯25；所述转基因植物的构建方法具体如下：基于发根农杆菌的原位转化技术，将含有所述组合基因 ruby的增强型超表达载体转入植物基因组中，筛选获得块根富含甜菜红素并呈粉红色的转基因甘薯植株。转基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种甜菜红素生物合成组合基因，由CYP76AD1基因、DODA基因和GT基因通过编码可自行切割的2A肽序列依次串联组成，所述CYP76AD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述DODA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述GT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.含有参与甜菜红素合成的组合基因RUBY的增强型重组表达载体。
3.根据权利要求2所述的增强型重组表达载体，包括分别与含COR47-5′UTR翻译起始增强子序列的2×35S启动子和HSP-T878终止子融合的RUBY基因的表达盒。
4.根据权利要求3所述的增强型重组表达载体，其特征在于，所述增强型重组表达载体是在pCAMBIA1300-eYGFPuv-Flag-MYC载体的Kpn I和Spe I酶切位点之间连入甜菜红素生物合成组合基因RUBY的核苷酸序列。
5.含有如权利要求2至4任一项所述增强型重组表达载体的微生物转化体。
6.根据权利要求5所述的微生物转化体，其特征在于，所述微生物转化体为发根农杆菌K599。
...【技术特征摘要】
1.一种甜菜红素生物合成组合基因，由cyp76ad1基因、doda基因和gt基因通过编码可自行切割的2a肽序列依次串联组成，所述cyp76ad1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述doda基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述gt基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。
2.含有参与甜菜红素合成的组合基因ruby的增强型重组表达载体。
3.根据权利要求2所述的增强型重组表达载体，包括分别与含cor47-5′utr翻译起始增强子序列的2×35s启动子和hsp-t878终止子融合的ruby基因的表达盒。
4.根据权利要求3所述的增强型重组表达载体，其特征在于，所述增强型重组表达载体是在pcambia1300-eygfpuv-flag-myc载体的kpn i和spe i酶切位点之间连入甜菜红素生物合成组合基因ruby的核苷酸序列。
5.含有如权利要求2至4任一项所述增...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱明库，吕雨蒙，孟小庆，刘维威，于婧，洪海婷，王锦尧，王艺霏，刘思媛，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：
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