【技术实现步骤摘要】
本专利技术创造涉及基因检测，尤其涉及了一种基于数字pcr方法检测人乳头瘤病毒核酸14分型的引物和探针组合、试剂盒及应用。
技术介绍
1、人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)属于乳头瘤病毒科，是一组能够感染人类皮肤和黏膜的环状双链dna病毒，hpv具有组织特异性，通过感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，从而引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤，因此，准确快速地鉴定出具体的hpv类型对于疾病的早期诊断、治疗及预后评估具有重要意义。
2、目前对于人乳头瘤病毒的主要检测方法有基于ngs的检测技术，荧光pcr的检测技术，基因芯片或者杂交捕获检测技术，但均为定性检测技术。通常情况下，hpv的感染大部分是一过性感染，只有持续性的高危型别感染会使宫颈癌的发生概率大大增加，且hpv病毒载量直接反映了hpv在体内的增殖情况，病毒载量越高，机体清除难度越大，发生持续感染的概率越高，仅靠定性检测无法获取hpv病毒载量，进而影响疾病的早期诊断及治疗效果。因此急需开发一种能够直接反应hpv病毒载量的定量检测技术，便于实时监测患者体内hpv病毒载量的变化情况，辅助医生进行诊断。
3、而微滴式数字pcr(ddpcr，droplet digital pcr)是一种基于传统pcr技术的核酸定量分析方法，其核心原理是将含有dna模板的反应体系分配到大量独立的微反应单元中进行扩增和光学检测，从而实现绝对定量分析。与传统的定量pcr(qpcr)不同，ddpcr不需要标准曲线来确定目标序列的起始浓度，由于它不依赖
4、专利cn105018647b公开了一种基于数字pcr精准定量分型检测hpv16/18的试剂盒及其检测方法，可以在hpv含量极低的组织样品检测中对样品溶液采用微滴化处理，根据荧光类型和荧光微滴个数直接判读hpv型别和拷贝数，大大简化了操作步骤，提高了检测准确度和重现性，但是仅能检测hpv16和hpv18两种hpv分型，并且检测时间需要3h，检测灵敏度最低只能到1拷贝。
5、专利cn106191317a公开了一种基于数字pcr检测hpv16病毒的引物对及其试剂盒，该试剂盒可通过数字pcr方法检测hpv病毒，但仅能检测hpv16分型，最低检出限仅为1个拷贝。
6、专利cn118360437a公开了一种用于hpv相关肿瘤的早筛和监测试剂盒，用于人血浆中游离hpv的检测，通过混合探针可在一个反应体系中同时检测到人血浆中游离hpv16/18/52/56，并且可对其进行准确分型，但也仅能检测四种分型，最低检出限为250copies/ml。
7、目前，现有的微滴式数字pcr技术能够检测的hpv分型较少，难以实现hpv多种分型的检测，主要是由于不同hpv类型的基因序列差异较小，特别是对于高危型别之间的差异更为细微，增加了设计出高度特异性而不产生交叉反应的引物和探针的难度，而检测分型越多用到的引物越多，引物之间越容易产生交叉反应而影响检测的准确度、特异性和灵敏度。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中的不足，需要一种能够同时检测多种hpv分型并直接反应hpv病毒载量的定量检测技术，本专利技术创造提供了一种基于数字pcr方法检测人乳头瘤病毒核酸14分型的引物和探针组合、试剂盒及应用，可以检测出14种hpv分型。
2、一种基于数字pcr方法检测人乳头瘤病毒核酸14分型的引物和探针组合，包括引物对以及与每对引物对相匹配的探针，其核苷酸序列如seq id no：1～42所示；其中，所述引物对包括人乳头瘤病毒核酸14分型对应的正向引物和反向引物。
3、优选的，人乳头瘤病毒核酸14分型的引物和探针组合如下：
4、针对hpv-18型的引物和探针组合，其核苷酸序列包括如seq id no.1所示的特异性正向引物序列、如seq id no.2所示的特异性反向引物序列和如seq id no.3所示的探针序列；
5、针对hpv-59型的引物和探针组合，其核苷酸序列包括如seq id no.4所示的特异性正向引物序列、如seq id no.5所示的特异性反向引物序列和如seq id no.6所示的探针序列；
6、针对hpv-68型的引物和探针组合，其核苷酸序列包括如seq id no.7所示的特异性正向引物序列、如seq id no.8所示的特异性反向引物序列和如seq id no.9所示的探针序列；
7、针对hpv-33型的引物和探针组合，其核苷酸序列包括如seq id no.10所示的特异性正向引物序列、如seq id no.11所示的特异性反向引物序列和如seq id no.12所示的探针序列；
8、针对hpv-52型的引物和探针组合，其核苷酸序列包括如seq id no.13所示的特异性正向引物序列、如seq id no.14所示的特异性反向引物序列和如seq id no.15所示的探针序列；
9、针对hpv-66型的引物和探针组合，其核苷酸序列包括如seq id no.16所示的特异性正向引物序列、如seq id no.17所示的特异性反向引物序列和如seq id no.18所示的探针序列；
10、针对hpv-31型的引物和探针组合，其核苷酸序列包括如seq id no.19所示的特异性正向引物序列、如seq id no.20所示的特异性反向引物序列和如seq id no.21所示的探针序列；
11、针对hpv-51型的引物和探针组合，其核苷酸序列包括如seq id no.22所示的特异性正向引物序列、如seq id no.23所示的特异性反向引物序列和如seq id no.24所示的探针序列；
12、针对hpv-35型的引物和探针组合，其核苷酸序列包括如seq id no.25所示的特异性正向引物序列、如seq id no.26所示的特异性反向引物序列和如seq id no.27所示的探针序列；
13、针对hpv-16型的引物和探针组合，其核苷酸序列包括如seq id no.28所示的特异性正向引物序列、如seq id no.29所示的特异性反向引物序列和如seq id no.30所示的探针序列；
14、针对hpv-45型的引物和探针组合，其核苷酸序列包括如seq id no.31所示的特异性正向引物序列、如seq id no.32所示的特异性反向引物序列和如seq id no.33所示的探针序列；
15、针对hpv-39型的引物和探针组合，其核苷酸序列包括如seq id no.34所示的特异性正向引物序列、如seq id no.35所示的特异性反向引物序列和如seq id no.36所示的探针序列；
16、针对hpv-56型的引物和探针组合，其核苷酸序列包括如seq id no.37所示的特异本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于数字PCR方法检测人乳头瘤病毒核酸14分型的引物和探针组合，其特征在于，包括引物对以及与每对引物对相匹配的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～42所示；其中，所述引物对包括人乳头瘤病毒核酸14分型对应的正向引物和反向引物。
2.根据权利要求1所述的基于数字PCR方法检测人乳头瘤病毒核酸14分型的引物和探针组合，其特征在于，所述数字PCR方法检测的人乳头瘤病毒核酸14分型为HPV18、HPV59、HPV68、HPV33、HPV52、HPV66、HPV31、HPV51、HPV35、HPV16、HPV45、HPV39、HPV56、HPV58。
3.根据权利要求1所述的基于数字PCR方法检测人乳头瘤病毒核酸14分型的引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针组合还包括内标引物对和探针，所述内标引物对和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.43～SEQ ID NO.45所示。
4.根据权利要求1所述的基于数字PCR方法检测人乳头瘤病毒核酸14分型的引物和探针组合，其特征在于，所述探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团；所述荧
5.一种数字PCR方法检测人乳头瘤病毒核酸14分型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的引物和探针组合、PCR反应液、阴性对照和阳性对照；其中，所述阴性对照为DEPC水，所述阳性对照为14种分型质粒混合液和内标基因质粒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括所述引物和探针组合、2x PCR MIX、DNA模板和DEPC.H2O，其中，所述2x PCRMIX为核酸扩增反应试剂，包括DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、缓冲液。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括第一PCR反应液，第二PCR反应液、第三PCR反应液和第四PCR反应液；
8.一种基于权利要求5所述的试剂盒在利用数字PCR方法检测人乳头瘤病毒基因分型中的应用。
9.根据权利要求8所述的利用数字PCR方法检测人乳头瘤病毒基因分型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的利用数字PCR方法检测人乳头瘤病毒基因分型的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的反应程序为：50℃5min；95℃2min；95℃15s，55℃30s，45个循环。
...【技术特征摘要】
1.一种基于数字pcr方法检测人乳头瘤病毒核酸14分型的引物和探针组合，其特征在于，包括引物对以及与每对引物对相匹配的探针，其核苷酸序列如seq id no：1～42所示；其中，所述引物对包括人乳头瘤病毒核酸14分型对应的正向引物和反向引物。
2.根据权利要求1所述的基于数字pcr方法检测人乳头瘤病毒核酸14分型的引物和探针组合，其特征在于，所述数字pcr方法检测的人乳头瘤病毒核酸14分型为hpv18、hpv59、hpv68、hpv33、hpv52、hpv66、hpv31、hpv51、hpv35、hpv16、hpv45、hpv39、hpv56、hpv58。
3.根据权利要求1所述的基于数字pcr方法检测人乳头瘤病毒核酸14分型的引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针组合还包括内标引物对和探针，所述内标引物对和探针的核苷酸序列如seq id no.43～seq id no.45所示。
4.根据权利要求1所述的基于数字pcr方法检测人乳头瘤病毒核酸14分型的引物和探针组合，其特征在于，所述探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团；所述荧光基团包括fam、hex、rox、cy5中的任意一种；所述淬灭基团包括bhq1、bhq2中的...
【专利技术属性】
技术研发人员：操利超，陈莹莹，张核子，巴颖，郑志慧，李飞飞，卫鸿杰，
申请(专利权)人：深圳市核子基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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