【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白质或多肽翻译后修饰的检测，具体涉及检测目标蛋白半胱氨酸亚磺酰化修饰的方法及其应用。
技术介绍
1、细胞正常生理或病理过程中均伴随着活性氧(reactive oxygen species，ros)的产生，当机体受损或病变时会产生高浓度ros，从而引起氧化应激或蛋白质的氧化翻译后修饰(oxidativepost-translational modifications，oxiptms)，该过程将蛋白质中半胱氨酸(cysteine，cys)残基的硫醇基团(thiol，-sh)氧化成亚磺酰化(s-sulfenylation，-soh)、次磺酰化(-sulfinylation，-so2h)或磺酰化(s-sulfonylation，-so3h)等形式，对细胞和组织造成氧化损伤，引发癌症、高血压、帕金森病或阿尔茨海默病等疾病。其中，亚磺酰化修饰是一种可逆的、氧化还原依赖的修饰，可以改变蛋白质的构象和功能，进而影响细胞的信号传导、代谢、生长和分化等过程。因此，对蛋白质亚磺酰化修饰进行研究，能更全面地理解多种生物的生存机制，促进对疾病发生机制的认识，为疾病的诊断和治疗提供新的靶点。
2、亚磺酰化修饰蛋白质的捕获、富集和修饰位点的确定仍极具挑战性，半胱氨酸亚磺酰化的检测方法主要包括基于转录因子yap1和基于小分子化合物dimedone或bicyclo[6.1.0]nonyne的分子探针。在此基础上，通过偶联生物素等标签分子又设计出了更多便于富集亚磺酰化蛋白质的衍生物探针。将亚磺酰化蛋白质捕获和富集后，与lc-ms/ms等
3、综合来说，已有的检测方法仍存在步骤复杂、操作耗时长，不能直接对发生亚磺酰化修饰的蛋白质进行生物素标记；以及无法在动物体内进行标记的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的首要目的在于提供一种检测目标蛋白半胱氨酸亚磺酰化的方法，该方法采用特定的btd探针结合无铜点击化学连接分子标签，可灵敏地在活体细胞内原位将发生亚磺酰化修饰的蛋白质标记上分子标签，不仅简化了标记流程，并且可在动物模型内进行亚磺酰化修饰水平的检测，在更贴近活体状态下检测蛋白质亚磺酰化修饰的动态水平变化。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、本专利技术第一方面提供了一种检测目标蛋白半胱氨酸亚磺酰化修饰的方法，本专利技术中通过特定的btd探针结合无铜点击化学连接分子标签，从而实现在活体细胞内原位将发生亚磺酰化修饰的蛋白质标记上分子标签，简化标记流程，在更贴近活体状态下检测蛋白质亚磺酰化修饰的动态水平变化。本专利技术中的方法不仅能够检测发生亚磺酰化修饰的蛋白；还可以检测发生亚磺酰化修饰蛋白质的修饰氨基酸位点。
4、在本专利技术中，所述检测目标蛋白半胱氨酸亚磺酰化修饰的方法主要包括以下步骤：
5、s1、使用btd-az探针标记目标蛋白半胱氨酸亚磺酰化修饰位点
6、本专利技术中所述btd-az探针的分子结构如下所示:
7、
8、其合成路径如下：
9、
10、具体操作时，将准备好的细胞在含有btd-az探针的培养基中进行培养即可实现标记。具体探针的用量可根据细胞的数量等进行选择，本领域技术人员具备这样的能力，故而没有特殊的限制。
11、s2、采用无铜点击化学反应在所述btd-az探针上连接分子标签捕获目标蛋白
12、在本专利技术中采用的无铜点击化学反应为叠氮化物-炔烃环加成(spaac)。所述的无铜点击化学反应包括btd探针标记目标蛋白与带有分子标签的生物分子连接的步骤，具体的连接方式和反应条件为本领域技术人员基于不同的生物分子通过已知的方法能够确认的，这里不再具体阐述。
13、在本专利技术中，所述的分子标签为本领域中较为常见的诸如生物素、荧光素(例如fam)等，但并不限于此。根据采用的分子标签的不同，选择的带有分子标签的生物分子也会有所差异。在本专利技术一些较优的实施方式中，采用的分子标签为生物素，采用的带有分子标签的生物分子即为带有生物素标签的生物分子，具体可提及的实例有pc dbco-peg3-biotin、diazo biotin-peg3-dbco、dde biotin-peg4-dbco、uv cleavable biotin-peg3-dbco或dbco-peg4-biotin，但并不限于此。
14、s3、提取目标蛋白并富集带有标签的目标蛋白，对目标蛋白进行检测；或者，提取目标蛋白并富集带有标签的目标蛋白，去除标签，对目标蛋白进行检测
15、在本专利技术的一些实施方式中，步骤s3为提取目标蛋白并富集带有标签的目标蛋白，对目标蛋白进行检测。通过提取目标蛋白并富集带有标签的目标蛋白后，对目标蛋白进行检测，从而实现检测亚磺酰化修饰的蛋白的目的。
16、在本专利技术的另一些实施方式中，步骤s3为提取目标蛋白并富集带有标签的目标蛋白，去除标签，对目标蛋白进行检测。通过提取目标蛋白并富集带有标签的目标蛋白后，去除标签，对目标蛋白进行检测，从而实现检测发生亚磺酰化修饰蛋白质的修饰氨基酸位点的目的。
17、进一步的，在本专利技术中蛋白的富集方式可以采用本领域中的常规方法，具体根据选择的分子标签的不同而有所差异，例如在一些实施案例中，分子标签为生物素标签，则此时采用链霉亲和素偶联生物素实现蛋白的富集，其中，链霉亲和素的形式例如可以是链霉亲和素磁珠或者链霉亲和素凝胶。又如在另一些实施案例中，分子标签为荧光素(例如fam)，则此时采用抗fam的抗体来实现蛋白的富集。
18、同样的，去除标签的方式没有特别的限定，根据选择的带有分子标签的生物分子种类的不同而进行具体的选择。例如在本专利技术的一些具体的实施案例中，采用的带有分子标签的生物分子为pc dbco-peg3-biotin，则后续标签去除通过光裂解释放实现。又如在本专利技术的一些具体的实施案例中，采用的带有分子标签的生物分子为diazo biotin-peg3-dbco，其中，带有的diazo基团可以在50mm连二亚硫酸钠溶液的温和条件下释放。具体去除方式本领域技术人员可以基于已知的生物分子种类和方法确定。
19、进一步的，在本专利技术中所述富集带有标签的目标蛋白，去除标签的步本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测目标蛋白半胱氨酸亚磺酰化修饰的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无铜点击化学反应为SPAAC。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无铜点击化学反应包括将BTD探针标记目标蛋白与带有分子标签的生物分子连接的步骤。
4.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述分子标签为生物素或荧光素；
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述带有分子标签的生物分子为PC DBCO-PEG3-Biotin、Diazo Biotin-PEG3-DBCO、Dde Biotin-PEG4-DBCO、UV Cleavable Biotin-PEG3-DBCO或DBCO-PEG4-Biotin。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取目标蛋白的过程是采用裂解缓冲液裂解细胞后离心实现的。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述富集带有标签的目标蛋白，去除标签的步骤依次为：
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测采用LC-MS/
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测还包括对目标蛋白半胱氨酸亚磺酰化修饰定量的步骤；
10.一种用于检测目标蛋白半胱氨酸亚磺酰化修饰的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有BTD-Az探针，并执行如权利要求1-9任一项所述的方法。
...【技术特征摘要】
1.一种检测目标蛋白半胱氨酸亚磺酰化修饰的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无铜点击化学反应为spaac。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无铜点击化学反应包括将btd探针标记目标蛋白与带有分子标签的生物分子连接的步骤。
4.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述分子标签为生物素或荧光素；
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述带有分子标签的生物分子为pc dbco-peg3-biotin、diazo biotin-peg3-dbco、dde biotin-peg4-dbco、uv cleavable bio...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙雪丹，许明悠，年永，王莉莉，杨姝，尚希福，刘连新，
申请(专利权)人：安徽省立医院中国科学技术大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：
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