【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和蛋白质表达领域，具体涉及salsolinol合成酶的体外表达和分离纯化，利用基因工程技术制备高纯度的酶。
技术介绍
1、儿茶酚异喹啉类物质(ctiqs)能够导致多巴胺能神经元的损伤，被认为是能引起帕金森病(parkinson’s disease,pd)的潜在内源性神经毒素。salsolinol合成酶是该类物质脑内合成过程中的首个关键酶，它是一种催化多巴胺(dopamin,da)和乙醛(ach)生成salsolinol的酶，直接影响到sal及其衍生物在体内的代谢过程，可能作为关键因子在pd致病过程中发挥重要作用。课题组前期已建立了从生物体内(sd大鼠鼠脑)分离纯化salsolinol合成酶的方法，并鉴定其氨基酸序列，然而体内分离纯化酶的方法生成成本高、酶回收率低，无法满足体外对该酶生物学性质的广泛研究。本专利技术基于salsolinol合成酶的氨基酸序列，构建高效的体外表达载体并制备高纯度酶，为后续针对此酶的酶性质研究提供基础。
技术实现思路
1、本专利技术解决的技术问题是提供了salsolinol合成酶体外载体的构建及其纯化制备方法。
2、本专利技术首先构建带有组氨酸标签(6×his)的salsolinol合成酶表达载体，表达载体为pet-28a，并导入宿主细胞诱导表达；采用亲和层析、凝胶过滤层析等方法获得高纯度酶，并进行酶活测定。
3、具体内容如下：
4、(1)salsolinol合成酶表达载体的构建
5、课
6、所述his-salsyn的核苷酸序列为：
7、catcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcgcagccatatggctagcatgactggtgacagcaaatgggtcgcggatccgaattcatgcaaatcttcgtgaagaccctgaccggcaagaccatcaccctggaggtggagcccagtgacaccatcaagaacgtgaaggccaagatccaggataaggagggcatcccccctgaccagcagaggctcatctttgccggcaagcagctggaagatggccgcaccctctctgactacaacatccagaaaaagtcaaccctgcacctagtcctccgcctgagggttgactattaa
8、其中：catcatcatcatcatcac是his标签；agcagcggcctggtgccgcgcggcgcagccatatggctagcatgac tggtgacagcaaatgggtcgcggatccgaattc是linker及t7tag；atgcaaatcttcgtgaagaccctgaccggcaagaccatcaccctggaggtggagcccagtgacaccatcaagaacgtgaaggccaagatccaggataaggagggcatcccccctgaccagcagaggctcatctttgccggcaagcagctggaagatggccgcaccctctctgactacaacatccagaaaaagtcaaccctgcacctagtcctccgcctgagggttgactat是salsolinol合成酶基因序列；taa是终止密码子。
9、所述his-salsyn-his的核苷酸序列为：
10、catcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcggcagccatatggctagcatgactggtgacacgaaatgggtcgcggatccgaattcatgcaaatcttcgtgaagaccctgaccggcaagaccatcaccctggaggtggagcccagtgacaccatcaagaacgtgaaggccaagatccaggataaggagggcatcccccctgaccagcagaggctcatctttgccggcaagcagctggaagatggccgcaccctctctgactacaacatccagaaaaagtcaaccctgcacctagtcctccgcctgagggttgactatctcgagcaccaccaccaccaccac
11、其中：catcatcatcatcatcac是his标签；agcagcggcctggtgccgcgcggcggcagccatatggctagcatgactggtgacacgaaatgggtcgcggatccgaattc是linker及t7tag；atgcaaatcttcgtgaagaccctgaccggcaagaccatcaccctgg
12、aggtggagcccagtgacaccatcaagaacgtgaaggccaagatcc
13、aggataaggagggcatcccccctgaccagcagaggctcatctttgc
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15、cagaaaaagtcaaccctgcacctagtcctccgcctgagggttgactat是salsolinol合成酶基因序列；ctcgagcaccaccaccaccaccac是linker及his标签。
16、(2)salsolinol合成酶的诱导表达与分离纯化
17、将步骤(1)得到的两种salsolinol合成酶表达载体转化到表达菌株bl21(de3)上，转化后的单菌落分别接种在含有卡纳霉素抗性的lb培养基中，当菌液od值在0.6-0.8时，使用iptg诱导并收集菌体。使用tris buffer重悬，超声破碎后离心或过滤，得到菌体上清液，上清液采用ni-nta层析柱分离得到salsolinol合成酶蛋白粗样品；随后将salsolinol合成酶蛋白粗样品上样至凝胶过滤层析柱中进一步纯化得到salsolinol合成酶样品。
18、(3)salsolinol合成酶的功能鉴定
19、为验证纯化出的salsolinol合成酶蛋白是否具有相应催化活性，我们根据其可催化的酶促反应设计实验以验证其活性。在体系中加入底物ach和多巴胺da，并在16-37℃条件下孵育40min，对反应产物进行酸沉淀后使用lc/ms检测，并与salsolinol标准样品对比，确认纯化出的salsolinol合成酶具有活性。
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1.Salsolinol合成酶，其特征在于基因序列为：
2.Salsolinol合成酶的诱导表达与分离纯化方法，其特征在于，
【技术特征摘要】
1.salsolinol合成酶，其特征在于基因序列为：
...
【专利技术属性】
技术研发人员：张桂铭，陈薛钗，孙书鸿，张鸿睿，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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