【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学诊断，尤其涉及一种基于crispr-cas13d的塞内卡谷病毒的可视化检测方法。
技术介绍
1、塞内卡病毒(senecavirus a,sva)又称为塞内卡谷病毒(seneca valley virus,svv)，中文翻译名称又有塞内卡病毒a、塞内卡谷病毒、塞尼卡病毒和塞内加病毒。sva是一种单股正链rna病毒，属于微rna病毒科的塞内卡病毒属，基因组长约7.2kb，呈二十面体结构。其基因组由l区和三个主要蛋白质区域(p1、p2、p3)组成。p1多聚蛋白可以被水解为vp1、vp3和vpo蛋白，其中vpo在sva病毒组装过程中进一步水解为vp2和vp4。这四种蛋白——vp1、vp2、vp3和vp4——共同构成了病毒的衣壳。；p2和p3编码非结构蛋白，参与病毒复制。基因组两侧为5'utr和3'utr，后者接poly(a)尾。
2、sva，最初于2002年在美国的人类胎儿视网膜细胞系中被发现，但追溯至1988年已在美猪群中存在。自2015年传入广东后，sva迅速由南向北扩散，导致多省疫情。作为一种新发动物传染病，其传播和致病机制尚不明确，存在大规模暴发的风险，且目前无商品化疫苗，防控形势严峻。所以，快速、灵敏的临床即时检测对sva的防控至关重要。目前，rt-pcr、rt-qpcr是检测prrsv病毒标准而有效的诊断方法，具有较高的特异性和敏感性。但因需要专业的设备、有经验的技术人员等要求，且从采样到出结果的过程耗时较长。因此，rt-pcr难以满足大规模生产中的大规模现场即时检测需求(poct)。p>
3、对于poct(即时检验)，确保检测的准确性和便捷性至关重要。目前，诸如酶聚合酶扩增(rpa)、重组酶辅助扩增(raa)和环介导等温扩增(lamp)等温扩增技术，以及胶体基因免疫层析试纸条，在临床应用中颇为广泛。然而，这些方法各自存在一定的局限性。等温扩增技术可在恒温条件下高效扩增目标dna，具备高效的扩增能力和较强的抗抑制特性，但非特异性扩增可能影响结果准确性，成为其广泛应用的一个障碍。另一方面，胶体基因免疫层析试纸条在灵敏度和特异性之间难以取得平衡。
4、crispr/cas系统，源自细菌的基因编辑技术，已经成为分子生物学和基因组编辑领域不可或缺的工具，并被誉为“下一代分子诊断技术”的核心。该系统的主要组成部分包括：crispr序列：这是一类特定的dna序列，包含成簇规律间隔短回文重复(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats,crispr)，这些序列中嵌入了来自病毒的外源性dna片段，即所谓的“间隔序列”；cas蛋白：crispr相关蛋白(crispr-associatedproteins,cas)是一类核酸酶，负责识别并切割特定的dna或rna序列。不同类型的cas蛋白具备不同的功能和特性。cas13效应蛋白家族包括四种亚型：cas13a、cas13b、cas13c和cas13d。其中，cas13d因其在rna靶向方面的多项优势而受到关注。它具有小巧的结构、较高的靶向特异性以及非破坏性的编辑能力，在基因敲低、细胞及动物抗病毒防御，尤其是在最近的病毒检测应用中展示了巨大的潜力。然而，单独使用crispr/cas系统进行病毒检测，会有灵敏度和定量能力不足、样本处理复杂、定量检测困难、反应时间较长、假阳性结果、高成本及设备依赖、以及储存和运输等问题。这些不足限制了其在快速、低成本和高通量检测中的应用，特别是在资源有限的环境中。
技术实现思路
1、基于现有技术的缺点，本专利技术引入了核酸快速提取方法和多元化结果展示技术，简化了样品处理与检测结果的解读。首先利用等温扩增技术-raa对目标病毒序列进行扩增，再利用crispr-cas13d系统进行特异性识别和信号放大，最后利用多种可视化方法对检测结果进行可视化观察。基于以上原理，本专利技术开发出一种能够对sva病毒进行精准、快速的现场及时检测方法。以此为提升猪类养殖业对sva型病毒的检测能力，减少生物安全风险。具体方案如下：
2、本专利技术提供了一种基于crispr-cas13d检测塞内卡谷病毒的crrna，所述crrna分子的序列如seq id no.13所示。
3、本专利技术还提供了一种用于检测塞内卡谷病毒的产品，所述产品中含有上述crrna分子。
4、优选地，所述产品为试剂或试剂盒。
5、更优选地，所述试剂或试剂盒中还含有cas13d蛋白、rna荧光报告探针、以及用于raa扩增的上游引物和下游引物。
6、更优选地，所述上游引物和下游引物的序列分别如seq id no.3、6所示。
7、本专利技术还提供了上述crrna分子在制备检测塞内卡谷病毒产品中的应用。
8、优选地，所述产品为试剂盒。
9、更优选地，所述试剂盒中还含有cas13d蛋白、rna荧光报告探针、以及用于raa扩增的上游引物和下游引物。
10、更优选地，所述试剂盒的使用方法如下：
11、(1)以待测样本dna为模板扩增获得产物，体外转录获得ssrna；
12、(2)步骤(1)中获得的ssrna、cas13d蛋白、rna荧光报告探针、以及crrna分子在crispr-cas13d反应体系里反应；
13、(3)步骤(2)反应完毕后，将反应体系置于蓝光或紫外光下观察检测结果。
14、优选地，所述步骤(1)中扩增采用raa扩增方法。
15、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
16、本专利技术显著缩短了诊断时间、降低了成本，并且不需要依赖昂贵的专业设备，所设计的引物和crrna表现出极高的特异性和敏感性，保证了检测的准确性与效率。这种方法不仅操作简单、反应迅速，而且提供了易于理解的可视化输出。
17、因此，基于raa和crispr-cas13d的这一检测方案特别适用于sva的现场监测，有助于提升生猪养殖业中的病原体监控能力，降低生物安全风险。推广这项技术对于加强养殖场的疾病防控措施具有重要的实际意义。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种基于CRISPR-Cas13d检测塞内卡谷病毒的crRNA，其特征在于，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.13所示。
2.一种用于检测塞内卡谷病毒的产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的crRNA分子。
3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述试剂或试剂盒中还含有Cas13d蛋白、RNA荧光报告探针、以及用于RAA扩增的上游引物和下游引物。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO.3、6所示。
6.权利要求1所述的crRNA分子在制备检测塞内卡谷病毒产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中还含有Cas13d蛋白、RNA荧光报告探针、以及用于RAA扩增的上游引物和下游引物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的使用方法如下
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中扩增采用RAA扩增方法。
...【技术特征摘要】
1.一种基于crispr-cas13d检测塞内卡谷病毒的crrna，其特征在于，所述crrna分子的序列如seq id no.13所示。
2.一种用于检测塞内卡谷病毒的产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的crrna分子。
3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述试剂或试剂盒中还含有cas13d蛋白、rna荧光报告探针、以及用于raa扩增的上游引物和下游引物。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述上游引...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡成芳，赵磊，朱玲，青易，葛良鹏，曾秀，徐志文，刘作华，徐通，孙静，陈虹宇，梁浩，袁蓉，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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