【技术实现步骤摘要】
本申请涉及多肽合成领域，具体地，涉及一种含马来酰亚胺酸的环肽合成方法。
技术介绍
1、多肽是指多个氨基酸之间通过肽键连接在一起的化合物，全保护多肽是指氨基酸侧链中的活性基团均被保护基保护的多肽。环肽是指n端与c端以酰胺键连接而呈环状的多肽。天然环肽在药理学研究中起着重要作用，与直链肽相比，其对蛋白酶的抵抗性强并且构象柔韧性降低。天然环肽已达到药物的稳定性，效能和选择性标准，如许多天然环肽如万古霉素，环孢菌素a和罗米地辛之类的药物已被开发为药物。
2、马来酰亚胺常常被用于和蛋白上的巯基偶联以实现对蛋白的位点选择性修饰，它们之间的迈克尔加成反应选择性高、快速，同时条件也温和。实际上，已经有多个fda批准的抗体-药物缀合物是通过这类反应获得的。因此含马来酰亚胺酸的环肽具有非常广阔的应用前景。
3、在多肽的固相合成中，多肽从树脂上裂解的全保护裂解方法一般使用固定混合比例的tfa和dcm为裂解试剂，裂解后收集滤液，将滤液调成碱性后旋蒸得到全保护肽。在全保护肽环化合成环肽的过程中，也通常需要添加diea调节碱性进行环化。但是碱性环境会破坏马来酰亚胺环的结构，导致副产物的增加，使得产物的纯度和收率降低。
4、为解决上述问题，本申请提供了一种含马来酰亚胺酸的环肽合成方法，环化效果好，收率高，且所得环肽纯度高。
技术实现思路
1、本申请的目的在于针对现有技术中的不足，提供了一种含马来酰亚胺酸的环肽合成方法，环化效果好，收率高，且所得多肽和环肽产品干净，纯度高。p>
2、本申请所述含马来酰亚胺酸的环肽合成方法，其特征在于，包含以下步骤：使用树脂进行固相合成；
3、(a)缩合：
4、(a1)以n-端氨基和侧链活性基团被保护的氨基酸为原料进行缩合，最后以马来酰亚胺酸或马来酰亚胺酸-pegn，n＝2-24，为原料进行缩合得到n-端为马来酰亚胺酸的侧链全保护肽-树脂；
5、或者
6、(a2)以n-端氨基和侧链活性基团被保护的氨基酸为原料进行缩合，或以n-端氨基和侧链活性基团被保护的氨基酸为原料进行缩合，最后以boc-pegn，n＝2-24，为原料进行缩合；其中一个氨基酸的侧链活性基团为氨基，所述氨基连接马来酰亚胺酸或马来酰亚胺酸-pegn，n＝2-24，得到侧链上连接马来酰亚胺酸的侧链全保护肽-树脂；
7、步骤(a)中，其中侧链全保护肽中氨基酸的个数为4-60个，侧链全保护肽n端氨基的保护基是对甲基三苯甲基或对甲氧基三苯甲基，或侧链全保护肽的c端第3个至n端之间的其中一个氨基酸的侧链氨基的保护基是对甲基三苯甲基或对甲氧基三苯甲基，其余氨基酸的侧链保护基不是对甲基三苯甲基或对甲氧基三苯甲基；
8、(b)裂解：使用六氟异丙醇溶液为裂解试剂进行裂解得到氨基保护基对甲基三苯甲基或对甲氧基三苯甲基被脱除的全保护肽；
9、(c)环化：将全保护肽在缩合试剂5-8eq edci和5-8eq oxyma存在下进行环化反应，得到全保护环肽；
10、(d)脱保护：脱除保护基后得到含马来酰亚胺酸的环肽。
11、本申请所述的环肽合成方法，使用六氟异丙醇溶液为裂解试剂，可同时实现多肽从树脂上的裂解，和侧链全保护肽n端氨基上或氨基酸侧链氨基上对甲基三苯甲基或对甲氧基三苯甲基保护基的脱除，使得相应氨基酸上的氨基在环化反应中与c端氨基酸进行缩合，得到环肽。所述裂解试剂不会导致氨基酸侧链上其他保护基团如boc、叔丁基的脱除，避免副产物的生成，保证了环肽产物的纯度。而且所述裂解试剂裂解后无需调节裂解液为碱性，避免了碱性环境对马来酰亚胺环结构的破坏，减少了副反应，提高了产物的纯度。而以常规的tfa和dcm为裂解试剂时，对保护基对甲基三苯甲基或对甲氧基三苯甲基的裂解效果差，还会出现叔丁氧羰基保护基被裂解的情况，使得环化反应中副产物增加。
12、本申请所述的环肽合成方法，环化中使用edci和oxyma为缩合试剂，一方面不需要调节反应液为碱性条件，避免了对马来酰亚胺环结构的破坏，减少了副反应，另一方面edci和oxyma配合使用，可以环化完全且环化效果较好，得到纯度较高的环肽产物。而本申请申请人发现，使用dic和oxyma为缩合试剂，本步环化反应不能进行，将得到未环化产物。
13、本申请所述的环肽合成方法，侧链全保护肽n端氨基的保护基是对甲基三苯甲基或对甲氧基三苯甲基，或侧链全保护肽的c端第3个至n端之间的其中一个氨基酸的侧链氨基的保护基是对甲基三苯甲基或对甲氧基三苯甲基，缩合后得到含有马来酰亚胺酸的侧链全保护肽-树脂，使用六氟异丙醇溶液裂解时，侧链全保护肽从树脂上裂解得到游离的c端羧基，同时脱除侧链全保护肽n端氨基保护基对甲基三苯甲基或对甲氧基三苯甲基或氨基酸的侧链氨基保护基对甲基三苯甲基或对甲氧基三苯甲基，得到游离的侧链全保护肽n端氨基或侧链氨基，在后续的环化反应中，游离的c端羧基和游离的氨基之间环化形成酰胺键得到全保护环肽。例如侧链全保护肽n端氨基的保护基是对甲基三苯甲基或对甲氧基三苯甲基，环化反应中，c端羧基和n端氨基之间环化形成酰胺键；或者c端第3个氨基酸的侧链氨基的保护基是对甲基三苯甲基或对甲氧基三苯甲基，环化反应中，c端羧基和c端第3个氨基酸的侧链氨基之间环化形成酰胺键；或者例如c端第6个氨基酸的侧链氨基的保护基是对甲基三苯甲基或对甲氧基三苯甲基，环化反应中，c端羧基和c端第6个氨基酸的侧链氨基之间环化形成酰胺键；或者n端第2个氨基酸的侧链氨基的保护基是对甲基三苯甲基或对甲氧基三苯甲基，环化反应中，c端羧基和n端第2个氨基酸的侧链氨基之间环化形成酰胺键。
14、本申请所述的环肽合成方法，所述六氟异丙醇溶液为20-40％六氟异丙醇/二氯甲烷溶液或20-40％六氟异丙醇/二氯乙烷溶液。所述六氟异丙醇溶液用量为5-15ml/g树脂，优选10-12ml/g树脂，室温如20-30℃，优选25℃震荡裂解30min-3h，优选1-2h；可使用摇床震荡裂解。裂解后，除去树脂(可通过过滤除去)，收集滤液，树脂用有机溶剂洗涤，合并滤液和洗涤液，除去溶剂后得到全保护肽。所使用的有机溶剂可以为dcm、dmf、dmso、nmp、dmac。
15、本申请所述的环肽合成方法，将全保护肽使用有机溶剂溶解，控制浓度0.5-2mmol/l，优选1-2mmol/l，加入缩合试剂进行环化反应。所述环化反应的具体条件为室温如20-30℃，优选25℃，搅拌反应6-18h，优选10-15h，更优选12h。环化反应后，除去溶剂，得到全保护肽粗品，优选通过旋蒸除去溶剂。所使用的有机溶剂可以为dcm、dmf、dmso、nmp、dmac。
16、本申请所述的环肽合成方法，固相合成中使用的氨基酸在n-端被fmoc保护。其余氨基酸的侧链保护基根据氨基酸的不同，选择不可以在弱酸条件下脱除的保护基，如保护基可选自boc(叔丁氧羰基)、叔丁基、三苯甲基、pbf(2,2,4,6,7-五甲基苯并二氢呋喃-5-磺酰基)、oall本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种含马来酰亚胺酸的环肽合成方法，其特征在于，包含以下步骤：使用树脂进行固相合成；
2.根据权利要求1所述的环肽合成方法，其特征在于，所述六氟异丙醇溶液为20-40％六氟异丙醇/二氯甲烷溶液、20-40％六氟异丙醇/二氯乙烷溶液。
3.根据权利要求2所述的环肽合成方法，其特征在于，所述六氟异丙醇溶液用量为5-15mL/g树脂，室温震荡裂解30min-3h。
4.根据权利要求1所述的环肽合成方法，其特征在于，将全保护肽使用有机溶剂溶解，控制浓度0.5-2mmol/L，加入缩合试剂进行环化反应。
5.根据权利要求1所述的环肽合成方法，其特征在于，所述环化反应的具体条件为室温搅拌反应6-18h。
6.根据权利要求1-5任一所述的环肽合成方法，其特征在于，固相合成中使用的氨基酸在N-端被Fmoc保护。
7.根据权利要求1-5任一所述的环肽合成方法，其特征在于，其余氨基酸的侧链保护基不可以在弱酸条件下脱除；侧链保护基优选选自Boc(叔丁氧羰基)、叔丁基、三苯甲基、pbf(2,2,4,6,7-五甲基苯并二氢呋喃-5-
8.根据权利要求1-5任一所述的环肽合成方法，其特征在于，所述树脂为未改造的CTC树脂；取代度为0.2-1mmol/g，优选为0.35-0.5mmol/g。
9.根据权利要求1-5任一所述的环肽合成方法，其特征在于，所述马来酰亚胺酸为马来酰亚胺C2-C6烷酸，优选为马来酰亚胺丙酸、马来酰亚胺乙酸、马来酰亚胺丁酸、马来酰亚胺戊酸、马来酰亚胺己酸，更优选为3-马来酰亚胺丙酸。
10.根据权利要求1-5任一所述的环肽合成方法，其特征在于，所述n为5-20，更优选为10-15。
11.根据权利要求1-5任一所述的环肽合成方法，其特征在于，其中侧链全保护肽中氨基酸的个数为10-50个，优选12-30个，更优选12-20个。
...【技术特征摘要】
1.一种含马来酰亚胺酸的环肽合成方法，其特征在于，包含以下步骤：使用树脂进行固相合成；
2.根据权利要求1所述的环肽合成方法，其特征在于，所述六氟异丙醇溶液为20-40％六氟异丙醇/二氯甲烷溶液、20-40％六氟异丙醇/二氯乙烷溶液。
3.根据权利要求2所述的环肽合成方法，其特征在于，所述六氟异丙醇溶液用量为5-15ml/g树脂，室温震荡裂解30min-3h。
4.根据权利要求1所述的环肽合成方法，其特征在于，将全保护肽使用有机溶剂溶解，控制浓度0.5-2mmol/l，加入缩合试剂进行环化反应。
5.根据权利要求1所述的环肽合成方法，其特征在于，所述环化反应的具体条件为室温搅拌反应6-18h。
6.根据权利要求1-5任一所述的环肽合成方法，其特征在于，固相合成中使用的氨基酸在n-端被fmoc保护。
7.根据权利要求1-5任一所述的环肽合成方法，其特征在于，其余氨基酸的侧链保护基不可以在...
【专利技术属性】
技术研发人员：林仁松，谭保锋，姚爱红，程俊豪，
申请(专利权)人：江苏金斯瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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