【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，尤其涉及rna和dna双荧光激活细胞分选术及其在细胞亚型分型和细胞遗传物质研究中的应用。
技术介绍
1、睾丸以其高度复杂的基因表达谱而闻名，其中超过80％的蛋白质编码基因在该器官中转录。睾丸展现出与精子发生同步发生改变的基因类型最为多样(brawand,d.,soumillon,m.,necsulea,a.,julien,p.,csárdi,g.,harrigan,p.,weier,m.,liechti,a.,aximu-petri,a.,kircher,m.,et al.(2011).the evolution ofgene expression levelsin mammalian organs.nature 478,343-348.)，但睾丸rna总量是否也相应波动仍不明确。尽管人们对生殖细胞的转录多样性进行了广泛研究，但不同阶段的rna丰度动态变化及其生物学意义仍鲜有探索。准确的细胞亚型分型是研究遗产物质(dna、rna和蛋白质)发挥作用的基础，能够为很多疾病提供重要的研究依据，目前细胞亚型分型主要采用流式细胞术，但是缺乏针对dna和/或rna的精确的细胞亚型分型的方法。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种rna和dna双荧光激活细胞分选术及其在细胞亚型分型和细胞遗传物质研究中的应用，本专利技术提供的方法不仅扩展了传统基于hoechst的facs的能力，实现了已知细胞群体的分离，而且能够精确分类以往难以区分的细胞类型，如粗线期
2、本专利技术提供了rna和dna双荧光激活细胞分选术，包括以下步骤：
3、1)对细胞组织进行消化获得单细胞悬液；
4、2)将消化后的单细胞悬液进行dna和rna的双重染色；
5、3)对染色后的细胞进行流式细胞术分析荧光激活细胞分选；
6、所述dna染色液为hoechst 33342，所述rna染色液为rnaselecttm绿色荧光细胞染色剂。
7、优选的，步骤2)所述双重染色为将dna染色液hoechst 33342、rna染色液sytogreen和单细胞悬液混合、孵育。
8、优选的，所述孵育的温度为36～38℃，所述孵育的时间为25～35min。
9、优选的，所述dna染色液hoechst 33342的用量为3～8μg/106个细胞；所述rna染色液为rnaselecttm绿色荧光细胞染色剂的用量为450～550nmol/106个细胞。
10、本专利技术还提供了所述的rna和dna双荧光激活细胞分选术在细胞亚型分型中的应用。
11、优选的，所述细胞亚型分型包括生精细胞亚型分型。
12、优选的，所述生精细胞亚型分型将睾丸单细胞细化分群如下：分化型精原细胞、pre-leptotene精母细胞、leptotene/zygotene精母细胞、pachytene精母细胞、diplotene精母细胞、mi精母细胞、mii精母细胞、圆形精子细胞，长型精子细胞及sertoli支持细胞。
13、本专利技术还提供了所述的rna和dna双荧光激活细胞分选术在细胞遗传物质研究中的应用。
14、优选的，所述遗传物质研究包括rna丰度变化。
15、本专利技术还提供了所述的rna和dna双荧光激活细胞分选术在rna结合蛋白的功能研究中的应用。
16、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供了一种rna和dna双荧光激活细胞分选术(以下简称r&d-facs)及其在细胞亚型分型和细胞遗传物质研究中的应用，本专利技术通过对细胞中的rna和dna进行双重染色，能够有效的区分细胞不同阶段dna和rna变化的特征，能够更为精确的区分不同的细胞亚型，尤其是rna丰度动态变化较为丰富的生殖细胞。
17、进一步的，本专利技术提供的r&d-facs还能够对rna结合蛋白的功能进行研究，应用r&d-facs研究了rna结合蛋白ddx17在精子发生中的作用。在ddx17敲除(ko)后，观察到前l阶段rna丰度发生显著异常变化，ddx17在调节精子发生过程中的转录和转录后事件中发挥着关键作用，ddx17的缺失破坏了rna转录和可变剪接，导致dsb修复和同源染色体联会缺陷，最终导致精子发生失败和雄性不育；本专利技术提供的r&d-facs为进一步的精细研究精子发生过程中提供有效的手段，对后续精子异常以及不育的研究提供有效的方法。
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1.RNA和DNA双荧光激活细胞分选术，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的RNA和DNA双荧光激活细胞分选术，其特征在于，步骤2)所述双重染色为将DNA染色液Hoechst 33342、RNA染色液RNASelectTM绿色荧光细胞染色剂和单细胞悬液混合、孵育。
3.根据权利要求2所述的RNA和DNA双荧光激活细胞分选术，其特征在于，所述孵育的温度为36～38℃，所述孵育的时间为25～35min；
4.根据权利要求2所述的RNA和DNA双荧光激活细胞分选术，其特征在于，所述DNA染色液Hoechst 33342的用量为3～8μg/106个细胞；所述RNA染色液RNASelectTM绿色荧光细胞染色剂的用量为450～550nmol/106个细胞。
5.权利要求1～4任意一项所述的RNA和DNA双荧光激活细胞分选术在细胞亚型分型中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述细胞亚型分型包括生精细胞亚型分型。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述生精细胞亚型分型将睾丸单细胞细
8.权利要求1～4任意一项所述的RNA和DNA双荧光激活细胞分选术在细胞遗传物质研究中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述遗传物质研究包括RNA丰度变化。
10.权利要求1～4任意一项所述的RNA和DNA双荧光激活细胞分选术在RNA结合蛋白的功能研究中的应用。
...【技术特征摘要】
1.rna和dna双荧光激活细胞分选术，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的rna和dna双荧光激活细胞分选术，其特征在于，步骤2)所述双重染色为将dna染色液hoechst 33342、rna染色液rnaselecttm绿色荧光细胞染色剂和单细胞悬液混合、孵育。
3.根据权利要求2所述的rna和dna双荧光激活细胞分选术，其特征在于，所述孵育的温度为36～38℃，所述孵育的时间为25～35min；
4.根据权利要求2所述的rna和dna双荧光激活细胞分选术，其特征在于，所述dna染色液hoechst 33342的用量为3～8μg/106个细胞；所述rna染色液rnaselecttm绿色荧光细胞染色剂的用量为450～550nmol/106个细胞。
5.权利要求1～4任意一项所述的rna和dna双荧光激活细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨发，秦卫军，时浩鑫，李硕，张添，王若宇，史圣甲，温伟红，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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