【技术实现步骤摘要】
本专利技术实施例涉及弓形虫检测，具体涉及一种弓形虫伸长因子单克隆抗体在弓形虫检测中的应用及检测方法。
技术介绍
1、弓形虫，是一种呈世界性分布的危害极大的专性细胞内寄生虫，其感染的宿主范围广泛，包括鸟类、人类以及哺乳动物等。弓形虫主要寄生在有核细胞内，随血液流动，到达全身各部位，破坏大脑、心脏等器官，使宿主免疫力下降，甚至死亡。该种寄生虫病的传播不仅对畜牧业的可持续发展造成了严重影响，同时也威胁着人类的生命健康。因此，对于弓形虫病的预防和控制就十分关键，其中弓形虫的检测在预防弓形虫中发挥重要作用。
2、目前，弓形虫的常用检测方法主要包括病原学检测、免疫学检测和分子生物学检测。病原学检测，存在灵敏度低、耗时长、工作量大等缺点。免疫学检测，具有操作简单和特异性高的特点，但仍存在灵敏度低的缺点，无法对弓形虫早期感染进行及时检测。分子检测技术具有特异性强、灵敏度高的优点，但是具有耗时长、操作复杂、依赖大型仪器等弊端。因此，急需开发一种特异性强、灵敏度高且方便快捷的检测方法。
技术实现思路
1、为此，本专利技术实施例提供一种弓形虫伸长因子单克隆抗体在弓形虫检测中的应用及检测方法，以解决现有技术中由于弓形虫检测技术不完善而导致的灵敏度低、操作复杂、耗时长的问题。
2、为了实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：
3、根据本专利技术实施例的第一方面，本专利技术提供一种抗弓形虫伸长因子单克隆抗体在弓形虫检测中的应用，所述弓形虫伸长因子为ef-1α，抗基因
4、根据本专利技术实施例的第二方面，本专利技术提供一种检测弓形虫的方法，利用上述抗弓形虫伸长因子单克隆抗体进行检测。
5、进一步地，所述检测弓形虫的方法包括western-blot检测和间接免疫荧光实验鉴定。
6、进一步地，所述western-blot检测包括以下步骤：
7、s1：从感染弓形虫的昆小鼠体内纯化me49株和rh株弓形虫；
8、s2：配置蛋白裂解液，将纯化的虫体取出，加入5-10倍虫体体积的蛋白裂解液，于离心管中混匀；将离心管置于冰水混合物上，超声破碎细胞，至溶液澄清透亮后，离心10-15min；
9、s3：将离心所得的上清液转移到新的经过预冷的离心管中，再加入5×loadingbuffer，不断振荡混匀，100℃金属水浴锅中加热10-15min，即可得到虫体蛋白样本；
10、s4：配置12％的sds-page蛋白质电泳胶，在胶孔中加入步骤s3得到的虫体样本后开始进行电泳，电压设置为150v，时间设置为90min；电泳完成后，用塑料板将玻璃板撬开，再用另一块塑料板切掉全部的浓缩胶以及多余的分离胶，通过湿转法将分离胶中蛋白转入pvdf膜；
11、s5：将转好的pvdf膜取出，浸入配制好的脱脂乳中，4℃摇床上封闭过夜；将封闭好的膜取出，按需要的大小进行剪切，将膜加入到含有3ml脱脂乳和3ul抗弓形虫伸长因子单克隆抗体的孵育盒中，37℃恒温箱中摇床上孵育60min；取出pvdf膜放入新的干净的孵育盒中，加入3-5ml pbst溶液，置于摇床上洗涤，共3次，每次10min；加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠的二抗，用pbst按1：25000的比例稀释；37℃恒温箱中，摇床上孵育60min；取出孵育盒，将二抗倒掉，再加入3-5ml pbst溶液，置于摇床上洗涤，共3次，每次10min；
12、s6：配制超敏发光液，将pvdf膜取出，置于照胶板上，均匀滴加超敏发光液，用照胶仪观察。
13、进一步地，步骤s2中，所述蛋白裂解液包括1×pbs、50mm抗坏血酸钠、1％np-40、1％triton x-100、1％吐温-20、5mm edta、50mm四硼酸钠；超声条件为：功率10％、超声5s、间隔10s、总共6次；离心条件为：4℃，12000rmp。
14、进一步地，步骤s4中，所述湿转法的转膜条件为180ma，60min。
15、进一步地，步骤s5中，所述pbst的配置方法如下：取一个无菌蓝盖瓶，加入100ml的10x pbs缓冲液，使用900ml蒸馏水将10x pbs缓冲液稀释为1x浓度，搅拌均匀，加入0.1％tween-20，搅拌使其均匀混合。
16、进一步地，所述间接免疫荧光实验鉴定包括以下步骤：
17、s1：将1×105个从小鼠体内纯化得到的弓形虫速殖子均匀涂布在黏附载玻片上，室温静置风干；
18、s2：向细胞爬片上滴加1ml 4％多聚甲醛固定液，室温固定15min，吸去固定液后，用pbs清洗3次；
19、s3：向载玻片上滴加1ml 0.2％ tritonx-100，室温透化15min，吸去透化液后，用pbs清洗3次；
20、s4：向载玻片上滴加1ml 5％脱脂乳，37℃封闭45min；封闭完成后，向1ml 5％脱脂乳中以1：200的比例加入抗弓形虫伸长因子单克隆抗体作为一抗，健康小鼠血清为阴性对照，4℃孵育过夜，后用pbs清洗5-6次；
21、s5：将alexa488conjugated goat anti-mouse igg的二抗按照1：1000比例稀释于pbs中，并滴加在载玻片上，37℃孵育45min，后用pbs清洗5-6次；
22、s6：dapi避光染色3min后，用pbs清洗3遍，再滴加抗荧光淬灭剂封片，使用共聚焦荧光显微镜观察结果。
23、本专利技术实施例具有如下优点：
24、提早诊断和发现弓形虫感染对于控制这种疾病至关重要，本专利技术所述的抗弓形虫伸长因子ef-1α单克隆抗体是非常有潜力的应用于弓形虫病诊断的抗体，弓形虫延伸因子1-α表达高度保守，在该寄生虫的发病机制和宿主细胞侵袭中起重要作用，本专利技术中所述的抗基因号tgme49_286420的ef-1α的单克隆抗体为本专利技术中首次发现，在弓形虫中的表达非常特异，可以通过western-blot技术和间接免疫荧光技术检测弓形虫。
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1.一种抗弓形虫伸长因子单克隆抗体在弓形虫检测中的应用，其特征在于，所述弓形虫伸长因子为EF-1α。
2.一种检测弓形虫的方法，其特征在于，利用权利要求1中所述的抗弓形虫伸长因子单克隆抗体进行检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述检测弓形虫的方法包括Western-blot检测和间接免疫荧光实验鉴定。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Western-blot检测包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述蛋白裂解液包括1×PBS、50mM抗坏血酸钠、1％NP-40、1％Triton X-100、1％吐温-20、5mM EDTA、50mM四硼酸钠；超声条件为：功率10％、超声5s、间隔10s、总共6次；离心条件为：4℃，12000rmp。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S4中，所述湿转法的转膜条件为180mA，60min。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S5中，所述PBST的配置方法如下：取一个无菌蓝盖瓶，加入100mL
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述间接免疫荧光实验鉴定包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种抗弓形虫伸长因子单克隆抗体在弓形虫检测中的应用，其特征在于，所述弓形虫伸长因子为ef-1α。
2.一种检测弓形虫的方法，其特征在于，利用权利要求1中所述的抗弓形虫伸长因子单克隆抗体进行检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述检测弓形虫的方法包括western-blot检测和间接免疫荧光实验鉴定。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述western-blot检测包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s2中，所述蛋白裂解液包括1×pbs、50mm抗坏血酸钠、1％np-40、1％triton x-100、1％吐...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈启军，张义伟，姜宁，苏紫薇，李其龙，吕坤荧，韦智明，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：
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