【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种大肠杆菌nissle 1917组成型表达外源蛋白的方法。
技术介绍
1、大肠杆菌nissle 1917(escherichia colinissle 1917，ecn)是一株历史悠久的益生菌，由德国医生alfrednissle于1917年从一位健康士兵的粪便中分离。并且从1917年起，ecn作为医用药物mutaflor的主要活性成分，一直被用于治疗各种疾病和肠道功能障碍，临床使用至今已有超过100年的历史。ecn是研究最为深入的非乳酸益生菌之一，其特征为缺乏毒力因子、具有o6：k5：h1血清型、半粗糙o6-脂多糖(lps)表型、k5型荚膜以及三种不同的菌毛类型(f1a、f1c和卷曲菌毛)。ecn细胞内拥有一小一大稳定存在的两个内源隐秘质粒，被称为pmut1和pmut2，其分子量分别为3.2kb、5.5kb。pmut1具有典型的cole1复制起点，而pmut2具有cole1和cole2样复制位点。现有的认知中，虽然pmut1和pmut2都含有与质粒转移相关的mob基因，但缺少接合相关的其他组件，因此被认为是不可转移的。pmut2质粒还含有质粒中常见的维持质粒稳定性的relb-rele毒素-抗毒素系统。除这些基因外，两个质粒中的其他开放阅读框(orf)大多没有已知功能。这两个内源隐秘质粒在ecn中的功能尚不清楚，且对ecn没有带来任何可观测的表型。
2、ecn能够在肠道中长期稳定定植，并与肠上皮细胞进行相互作用，发挥免疫调节的生物学功能，被广泛应用于预防传染性腹泻、治疗炎性肠病如溃疡性
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种大肠杆菌nissle 1917组成型表达外源蛋白的方法，无需使用抗生素压力和诱导剂诱导即可实现外源蛋白在ecn工程菌中的组成型高效稳定表达。
2、本专利技术提供了一种大肠杆菌nissle 1917组成型表达外源蛋白的方法，包括以所述大肠杆菌nissle 1917的内源隐秘质粒pmut1和/或pmut2作为表达载体，向所述表达载体中插入含有tac启动子和突变型lac操纵子的外源蛋白的基因表达单元。
3、本专利技术一个优选方式中，所述突变型lac操纵子中的核苷酸序列包括由agcgg突变为gatcc。
4、本专利技术一个优选方式中，还包括在内源隐秘质粒pmut1和pmut2中引入不同的抗性基因。
5、本专利技术一个优选方式中，所述外源蛋白包括sod。
6、本专利技术提供了一种组成型表达外源蛋白的大肠杆菌nissle 1917工程菌的构建方法，包括以下步骤：
7、(1)将外源蛋白的编码基因插入质粒中构建得到重组质粒；所述质粒中包含tac启动子、lac操纵子和第一抗性单元；
8、(2)将步骤(1)所述重组质粒中lac操纵子中的核苷酸序列由agcgg突变为gatcc，获得突变重组质粒；利用所述突变重组质粒为模板扩增线性化含第一抗性单元、tac启动子、突变型lac操纵子和外源蛋白基因的片段，得第一线性化片段；
9、(3)将步骤(2)所述突变重组质粒中的第一抗性单元替换为第二抗性单元，利用含第二抗性单元的突变重组质粒为模板扩增线性化含第二抗性单元、tac启动子、突变型lac操纵子和外源蛋白基因的片段，得第二线性化片段；
10、(4)将扩增得到的线性化内源隐秘质粒pmut1和/或pmut2与步骤(2)所述第一线性化片段和/或步骤(3)所述第二线性化片段进行连接，构建得到突变重组内源隐秘质粒；
11、(5)利用步骤(4)所述包含外源蛋白基因片段的突变重组质粒转化大肠杆菌nissle 1917的感受态细胞，构建得到组成型表达外源蛋白的大肠杆菌nissle1917工程菌。
12、本专利技术一个优选方式中，步骤(1)所述外源蛋白为sod时，包括将所述sod的编码基因插入pgex-4t-1质粒中，生成重组质粒pgex-4t-1-rtsod-amp。
13、本专利技术一个优选方式中，所述第一抗性单元为amp抗性单元，第二抗性单元为kan抗性单元。
14、本专利技术还提供了利用上述构建方法构建得到的组成型表达外源蛋白的大肠杆菌nissle 1917工程菌。
15、本专利技术还提供了利用上述组成型表达外源蛋白的大肠杆菌nissle 1917工程菌表达外源蛋白的方法，利用所述组成型表达外源蛋白的大肠杆菌nissle 1917工程菌表达所述外源蛋白，无需诱导剂诱导和抗生素压力。
16、本专利技术还提供了上述组成型表达外源蛋白的大肠杆菌nissle 1917工程菌在制备活菌制剂中的应用。
17、有益效果：本专利技术提供了一种大肠杆菌nissle 1917组成型表达外源蛋白的方法，以nissle 1917为底盘菌株(后续nissle 1917简称为ecn)，通过改造内源隐秘质粒构建得到组成型表达外源蛋白的工程菌株，无需诱导剂的诱导和抗生素压力即可实现外源蛋白组成型表达的方法。本专利技术选择ecn菌株两个内源的隐秘质粒pmut1和pmut2作为表达载体，在不破坏质粒原有功能结构元件的情况下，可在两个隐秘质粒的任一合适位置分别插入含有tac启动子和突变型lac操纵子的基因表达单元片段，可用于两个外源基因的同时表达；同时在pmut1和pmut2载体的任一合适位置分别引入第一抗性基因和第二抗性基因，可以方便两个重组载体的构建和阳性克隆的筛选，重组载体构建成功后无需添加抗生素。
18、利用本专利技术所述方法，成功构建三种组成型表达rtsod蛋白的ecn工程菌ecnc-pmut1-rtsod、ecnc-pmut2-rtsod和ecnc-rtsod，无需使用抗生素压力和诱导剂诱导即可实现高稳定rtsod蛋白在ecn工程菌中的组成型高效表达，可作为一种潜在的活菌药物(lbp)，用于氧化应激相关疾病的预防和治疗。本专利技术还验证了所述重组隐秘质粒具有高稳定性，以及避免使用抗生素以减少抗生素抗性基因的传播和环境污染，因此，本专利技术所述方法对于ecn工程菌株的实际应用具有重要意义。
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1.一种大肠杆菌Nissle 1917组成型表达外源蛋白的方法，其特征在于，包括以所述大肠杆菌Nissle 1917的内源隐秘质粒pMUT1和/或pMUT2作为表达载体，向所述表达载体中插入含有Tac启动子和突变型lac操纵子的外源蛋白的基因表达单元。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述突变型lac操纵子的核苷酸序列包括由AGCGG突变为GATCC。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，还包括在内源隐秘质粒pMUT1和pMUT2中引入不同的抗性基因。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述外源蛋白包括SOD。
5.一种组成型表达外源蛋白的大肠杆菌Nissle 1917工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述构建方法，其特征在于，步骤(1)所述外源蛋白为SOD时，包括将所述SOD的编码基因插入pGEX-4T-1质粒中，生成重组质粒pGEX-4T-1-RtSOD-Amp。
7.根据权利要求5所述构建方法，其特征在于，所述第一抗性单元为Amp抗性单元，第二抗性单元为K
8.利用权利要求5～7任一项所述构建方法构建得到的组成型表达外源蛋白的大肠杆菌Nissle 1917工程菌。
9.利用权利要求8所述组成型表达外源蛋白的大肠杆菌Nissle 1917工程菌表达外源蛋白的方法，其特征在于，利用所述组成型表达外源蛋白的大肠杆菌Nissle 1917工程菌表达所述外源蛋白，无序诱导剂诱导和抗生素压力。
10.权利要求9所述组成型表达外源蛋白的大肠杆菌Nissle 1917工程菌在制备活菌制剂中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌nissle 1917组成型表达外源蛋白的方法，其特征在于，包括以所述大肠杆菌nissle 1917的内源隐秘质粒pmut1和/或pmut2作为表达载体，向所述表达载体中插入含有tac启动子和突变型lac操纵子的外源蛋白的基因表达单元。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述突变型lac操纵子的核苷酸序列包括由agcgg突变为gatcc。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，还包括在内源隐秘质粒pmut1和pmut2中引入不同的抗性基因。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述外源蛋白包括sod。
5.一种组成型表达外源蛋白的大肠杆菌nissle 1917工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述构建方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：聂作明，林奇，江卓，尤征英，蒋彩英，吕正兵，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：
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