【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于眼科生物医药领域，尤其是涉及一种高表达id3 mrna的脂质纳米颗粒制备方法及其在眼角膜损伤修复和瘢痕治疗中的应用。
技术介绍
1、角膜位于眼球最外层，易受到外界因素影响。各类致病微生物原、化学性烧伤、机械性损伤、电离辐射与steven-johnsons综合征等免疫性疾病均可导致不同程度的角膜损伤。各类角膜损伤治疗的难点在于角膜结构的修复及损伤修复过程中形成的角膜瘢痕，顽固的角膜瘢痕可永久性影响视力。目前，促进角膜损伤修复的药物治疗局限于各类表皮生长因子支持治疗，而各类表皮生长因子在角膜细胞的渗透性较差，且能够持续作用时间较短，还会对周边组织产生非特异性作用。目前，临床缺乏能够显著促进角膜损伤修复及抑制角膜瘢痕以提高视力的药物，是目前临床治疗中的瓶颈。
2、现有技术中，mrna载体的自身表达效率低，同时，在眼部环境中的递送效率较低，难以实现高效、稳定的基因表达。因此，开发一种能够有效递送mrna至眼部细胞实现mrna高表达的体系，对于提高眼部疾病治疗效果具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术的一个目的是克服上述
技术介绍
的不足，提供一种高表达id3 mrna的脂质纳米颗粒制备方法，所获得的脂质纳米颗粒能够在体内外高效表达id3 mrna基因。
2、本专利技术的第二个目的是所述高表达id3 mrna的脂质纳米颗粒应用于治疗多种眼角膜疾病。
3、本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
4、一种高表达id3 mrna的
5、1、pcr扩增mrna载体
6、1)所述mrna载体包括：
7、t7启动子序列：taatacgactcactata，
8、5’utr序列：agactcttctggtccccacagactcagagagaacccacc，
9、kozak序列：gccacc，
10、3’utr序列：
11、gctggagcctcggtggccatgcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccg tggtctttgaataaagtctgagtgggcggca，
12、多聚核苷酸尾部元件为120nt连续腺苷酸；
13、aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
14、2)pcr扩增条件：
15、95℃10s
16、58℃5s
17、72℃10s
18、pcr仪中扩增40个循环。
19、2、id3目的基因的orf片段插入所述mrna载体进行编码，得到含有目的基因的mrna载体质粒：
20、所述id3目的基因的orf片段,为如下的人源id3基因的开放阅读框序列片段：atgaaggcgctgagcccggtgcgcggctgctacgaggcggtgtgctgcctgtcggaacgcagtctggccatcgcccggggccgagggaagggcccggcagctgaggagccgctgagcttgctggacgacatgaaccactgctactcccgcctgcgggaactggtacccggagtcccgagaggcactcagcttagccaggtggaaatcctacagcgcgtcatcgactacattctcgacctgcaggtagtcctggccgagccagcccctggaccccctgatggcccccaccttcccatccagacagccgagctcactccggaacttgtcatctccaacgacaaaaggagcttttgccactga
21、编码步骤是：
22、(1)在离心管与试剂放置在冰上，pcr离心管中配置如下编码反应体系：
23、
24、(2)将上述试剂充分混匀，置于pcr机中进行反应，反应条件为：37℃下1.5h。
25、3、对含有目的基因的mrna载体质粒进行转化与提取，包括如下步骤：
26、(1)将pcr产物转入dh5α感受态细胞中进行转化，冰上静置30min；
27、(2)感受态细胞在42℃温水中热激90s，立刻置于冰上静置10min；
28、(3)将100μl感受态细胞加入提前预热的lb培养基中；取上述菌液涂布在含有质粒对应抗性的lb平板上，37℃培养箱中倒置培养过夜；
29、(4)挑选lb平板中生长的单克隆抗体，在含有抗性的lb培养基中振荡16h；
30、(5)菌液3000rpm离心，弃上清，使用质粒抽提试剂盒提取沉淀中的mrna载体质粒；
31、4、对提取的mrna载体质粒进行体外转录，合成含目的基因的线性化mrna质粒；
32、所述体外转录，包括如下步骤：
33、1)在pcr离心管中配置如下转录体系：
34、
35、2)体外转录条件包括：
36、37℃pcr仪中连接2小时；随后在上述转录体系中加入以下试剂，以形成加帽的mrna结构：
37、2’o-甲基转移酶2μl
38、gtp溶液2μl
39、s-腺苷蛋氨酸2μl
40、在37℃条件下继续反应1小时；
41、3)线性化mrna纯化：
42、(1)在步骤(2)转录生成的的线性化mrna溶液中加入dna酶(2u/μl)消化残余dna模板质粒；
43、(2)利用rna纯化试剂盒纯化所得线性化mrna；
44、(3)收集纯化所得线性化mrna并溶解于弱酸性缓冲液中，nanodrop仪器测量mrna浓度；
45、(4)纯化后的含线性化mrna质粒溶液分装并储存于-80℃冰箱。
46、5、制备mrna脂质纳米颗粒，以应用于眼用制剂；制备方法为：
47、(1)分别配置阳离子脂质体sm-102、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、dmg-peg聚合物无水乙醇溶液，四种试剂的浓度依次为：15mm、25mm、50mm、5mm；
48、(2)在离心管中分别加入上述溶液，获得四种试剂质量比例依次为50：38.5:10:1.5的混合溶液；
49、(3)使用ph 4.0的琥珀酸柠檬酸纳溶液，按照每1ug mrna对应6ul琥珀酸柠檬酸纳溶液的比例溶解含线性化mrna质粒溶液中的含线性化mrna质粒；
50、(4)将步骤(2)中混合溶液快速加入步骤(3)所得溶解溶液中，持续涡旋30s；sm-102与mrna质粒的质量比例为1:4.5-5:1，优选1:本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高表达ID3 mRNA的脂质纳米颗粒制备方法，依照如下步骤进行：
2.根据权利要求1所述的高表达ID3 mRNA的脂质纳米颗粒制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的PCR扩增条件为：
3.根据权利要求2所述的高表达ID3 mRNA的脂质纳米颗粒制备方法，其特征在于：所述步骤2)中的编码步骤包括：
4.根据权利要求3所述的高表达ID3 mRNA的脂质纳米颗粒制备方法，其特征在于：所述步骤3)中对含有目的基因的mRNA载体质粒进行转化与提取，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的高表达ID3 mRNA的脂质纳米颗粒制备方法，其特征在于：所述步骤4)中的体外转录，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的高表达ID3 mRNA的脂质纳米颗粒制备方法，其特征在于：所述步骤5)中mRNA脂质纳米颗粒的制备方法为：
7.根据权利要求6所述的高表达ID3 mRNA的脂质纳米颗粒制备方法，其特征在于：所述步骤3)的转化与提取中，使用质粒抽提试剂盒提取沉淀中的mRNA载体质粒。
8.权利要求1所述的高表达I
...【技术特征摘要】
1.一种高表达id3 mrna的脂质纳米颗粒制备方法，依照如下步骤进行：
2.根据权利要求1所述的高表达id3 mrna的脂质纳米颗粒制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的pcr扩增条件为：
3.根据权利要求2所述的高表达id3 mrna的脂质纳米颗粒制备方法，其特征在于：所述步骤2)中的编码步骤包括：
4.根据权利要求3所述的高表达id3 mrna的脂质纳米颗粒制备方法，其特征在于：所述步骤3)中对含有目的基因的mrna载体质粒进行转化与提取，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的高表达id3 mrna的脂质纳米颗粒制...
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