【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子诊断与液体活检，具体为一种基于食用白醋诱导分泌的胰液的液体活检方法。
技术介绍
1、随着现代医学技术的发展，包括肺癌在内多种实体肿瘤的发病率与死亡率都得以明显改善，但世界卫生组织/国际癌症研究署报道数据显示，胰腺癌的发病率在世界范围内仍呈上升趋势(klein ap.pancreatic cancer epidemiology:understanding the roleof lifestyle and inherited risk factors.nat rev gastroenterol hepatol.2021；18(7):493-502.doi:10.1038/s41575-021-00457-x)。根据我国国家癌症中心2017年统计数据，胰腺癌位居恶性肿瘤发生率第13位，其中居男性第7位，女性第11位；与此同时，胰腺癌恶性程度极高，高居我国恶性肿瘤相关死亡率第6位，患者确诊时多已丧失手术机会，预后极差，5年生存率仅8％～10％，而早期诊断困难被认为是最主要的原因(杨尹默,田孝东.中国胰腺癌诊治指南(2021).中国实用外科杂志,2021,41(07):725-738.doi:10.19538/j.cjps.issn1005-2208.2021.07.02.)。
2、现阶段，包含我国在内的大多数国家或区域的胰腺癌筛查工作主要依赖于血清学与影像学两项检查技术。血清学检查方面，以ca19-9、cea等为代表的血清肿瘤标志物与体内肿瘤负荷呈正相关，可提示潜在转移风险，甚至能评估治疗疗效与患者预后(z
3、随着人们对肿瘤发生发展机制认识的不断深入，近年来大量研究已证实以外周血和组织分泌物为代表的生物样本中存在多种与肿瘤密切相关的物质。通过检测其中的代谢物、生物标志物或基因组分，对于胰腺癌的早期诊断、生物学评估、用药指导、疗效监测及预后评估具有重要的临床意义与应用前景(kuwatani m,sakamoto n.pathological andmolecular diagnoses of early cancer with bile and pancreatic juice.digendosc.2022；34(7):1340-1355.doi:10.1111/den.14348)。然后，受限于胰液内容物繁杂，如高活性的胰酶可在短时间内消解核酸导致有意义突变无法测出，而丰富的结缔组织能对痕量胰腺癌dna提取产生不可忽视的干扰。此外，现阶段国内外不同团队提出的胰液收集方法差异较大，尚无得到广泛认可的安全、有效且标准化的方案，且收集的胰液样本缺乏有意义的质量监控手段。再者，国际上广泛用于促进胰液分泌的促胰液素在我国尚未获得cfda批准以用于人体，故目前我国尚无经高质量研究确证的促胰液分泌手段，导致在短时间内无法获取足量的胰液以用于后续分析；据此，北京协和医院消化内科内镜中心团队以胃酸刺激胰液分泌这一生理学基础为出发点，设计研究发现将我国商品化食用白醋(有效成分为5％乙酸溶液)灌注于十二指肠球降交界处数分钟可达到类似效果以在短时间内获取大量高质量胰液，具有极高的运用前景。然而目前对该白醋诱导分泌的胰液缺少有效的液体活检方案，该问题亟待解决。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足，特别是胰液样本获取困难与胰液中核酸酶对游离dna的消解问题，本专利技术提出了一种基于通过食用白醋诱导分泌的胰液的液体活检方法，旨在简便、安全且高效地提取并分析胰液中的游离dna，并进行疾病的靶标基因突变检测。
2、一种基于白醋诱导分泌的胰液的液体活检方法，包括以下步骤：
3、(1)向无菌收集瓶中加入胰蛋白酶抑制剂混合液和edta溶液并充分摇匀；
4、(2)收集白醋诱导分泌的胰液，进行两次离心，离心完成后收集上清液；
5、(3)从离心后的胰液上清液中提取游离dna；
6、(4)采用微滴式数字式聚合酶链反应对提取的游离dna的kr本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于白醋诱导分泌的胰液的液体活检方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中向无菌收集瓶中加入100x胰蛋白酶抑制剂混合液和0.5M的pH 8.0且无RNase的EDTA溶液，混合后，胰蛋白酶抑制剂混合液的终浓度为1x。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)制备的溶液在4℃环境下保存以备用。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中混合样本在5分钟内进行两次离心，第一次离心条件为在4℃下经低速离心15分钟，相对离心力为1600～1900g；第二次离心条件为在4℃下经高速离心15分钟，相对离心力为16000～17000g。
5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中第一次离心的余沉淀冻存于-80℃至-196℃的环境以备用，第二次离心得到的上清液保存于-80℃至-196℃的环境以备用。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中使用游离核酸cfDNA提取试剂盒及配套HF24全自动核酸纯化仪提取游离DNA，使用超微量分光光度
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中提取的游离DNA保存于-80℃至-196℃的环境以备用。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中采用微滴式数字式聚合酶链反应对提取的游离DNA的KRAS突变位点进行检测的步骤包括：
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(4)中PCR扩增条件包括：
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(4)中PCR扩增产物的保存温度为2～8℃。
...【技术特征摘要】
1.一种基于白醋诱导分泌的胰液的液体活检方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中向无菌收集瓶中加入100x胰蛋白酶抑制剂混合液和0.5m的ph 8.0且无rnase的edta溶液，混合后，胰蛋白酶抑制剂混合液的终浓度为1x。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)制备的溶液在4℃环境下保存以备用。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中混合样本在5分钟内进行两次离心，第一次离心条件为在4℃下经低速离心15分钟，相对离心力为1600～1900g；第二次离心条件为在4℃下经高速离心15分钟，相对离心力为16000～17000g。
5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中第一次离心的余沉淀冻存于-80℃至...
【专利技术属性】
技术研发人员：严志宇，施文，冯云路，张晟瑜，吴晰，杨爱明，徐滔，张玉衡，王强，蒋青伟，伍东升，郭涛，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：
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