【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业生物，尤其涉及一种用于转基因抗虫棉花bt蛋白高剂量表达的判断方法。
技术介绍
1、棉花是重要的经济作物，是天然纤维的主要来源，在国民经济中具有重要的地位。但在棉花生产上易受到害虫的侵害，因而造成巨大的损失。棉铃虫是棉花上危害最大的害虫，危害严重时甚至绝收。20世纪90年代，随着转基因技术的推广，转基因抗虫棉花逐渐成为主流。转基因抗虫棉花能有效控制棉铃虫，大大减少了杀虫剂的使用，解决了棉铃虫的抗药性问题，产生了极大的经济、生态、社会效益。
2、为了确保转基因抗虫棉花的持续健康发展，延缓棉铃虫对转基因抗虫棉花的抗药性，抗虫棉bt蛋白高剂量表达成为重要的抗药性治理策略。目前，抗虫棉bt蛋白高剂量表达的方法主要依靠酶联免疫法(elisa)进行bt蛋白含量判断。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是转基因抗虫棉花bt蛋白高剂量表达的判断，本专利技术提供了一种转基因抗虫棉花bt蛋白高剂量表达的判断方法。
2、本专利技术提出的技术方案是：
3、一种转基因抗虫棉花bt蛋白高剂量表达的判断方法，其特征在于，当转基因抗虫棉花同时满足下列条件时，判定转基因抗虫棉花bt蛋白为高剂量表达：
4、1)棉花组织bt蛋白表达量平均值大于450ng/g(鲜重)；
5、2)棉花叶片对靶标害虫抗虫性生物测定结果中幼虫校正死亡率平均值大于60％。
6、所述棉花组织为棉花苗期叶片、蕾期叶片、蕾期小蕾、铃期叶片、铃期小铃中的一种或几种。
7、所述棉花组织bt蛋白表达量使用elisa方法测定。
8、所述棉花叶片为在第2代靶标害虫发生盛期、第3代靶标害虫发生盛期、第4代靶标害虫发生盛期采集自适期播种且正常管理的棉花。
9、所述靶标害虫为棉铃虫。
10、具体的方案操作如下：
11、(1)在合适的时间采集棉花的苗期叶片、蕾期叶片、蕾期小蕾、铃期叶片、铃期小铃，使用retsch mm400组织破碎仪(retsch gmbh,haan,germany)将所有样本在低温下粉碎为粉末，然后保存在-80℃冰箱中。使用elisa方法测定抗虫棉花各个组织的bt蛋白含量，并计算平均值。
12、(2)elisa方法使用的试剂盒为envir logix公司qualiplate kits for cry1ab/cry1ac。按照说明书，称取0.4g组织粉末加入4ml提取液pbst(ph为7.4、浓度为0.01mol/l的pbs+0.55％ tween 20)，置于摇床上4℃过夜；12000r/min离心15min，取上清液，用提取液适量稀释；将cry1ab标准品梯度稀释，在96孔酶标板每孔加入50μl enzyme-conjugatecry1ab后，分别加入50μl样品、阴性对照和标准品，用封口膜将酶标板封闭，轻摇混匀20～30s，置于摇床上(200r/min)1～2h；用力弃去液体后，每孔加入200μl洗涤液，反复洗涤3次后用吸水纸吸干；每孔加入100μl显色底物，用封口膜将酶标板密封，外覆锡箔纸避光，轻摇混匀20～30s，室温放置15～30min；每孔加入100μl终止液终止反应，用infinite m200 pro酶标仪(tecan,switzerland)在450nm波长下测定od值。
13、(3)分别在第2代棉铃虫发生盛期、第3代棉铃虫发生盛期、第4代棉铃虫发生盛期采集棉花的叶片进行生物测定，计算第2-4代生测的棉铃虫幼虫校正死亡率的平均值。每个试验材料采上部展开叶片10片，每片叶接棉铃虫初孵幼虫5头，然后放入试验盒，重复3次。接虫后将试验盒置于光照培养箱[(温度为27℃±1℃，相对湿度为70％，光周期(光照时间∶黑暗时间)为14∶10]内，并于接虫后第6天检查其死虫数、活虫数，计算棉铃虫幼虫校正死亡率(xt，％)。计算公式：xt＝(x1－x0)/(1－x0)×100％。式中，x1为处理幼虫死亡率(％)，x0为对照幼虫死亡率(％)。
14、(4)结合蛋白和生测结果按照下表进行判断，当bt蛋白表达量平均值大于450ng/g鲜重，同时幼虫校正死亡率平均值大于60％时，判定为转基因抗虫棉花bt蛋白的高剂量表达。
15、 bt蛋白表达量级 bt蛋白表达量平均值(ng/g鲜重) 幼虫校正死亡率平均值(xt，％) 不表达 y≤5 / 低表达 5＜y≤150 / 中表达 150＜y≤300 / 中高表达 300＜y≤450 / 高表达 y＞450 >60
16、本专利技术的有益效果是：提供了棉花全生育期的bt蛋白表达量和叶片生测结果，提供了综合性的棉花bt蛋白的高剂量表达判断方法。
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1.一种转基因抗虫棉花Bt蛋白高剂量表达的判断方法，其特征在于，当转基因抗虫棉花同时满足下列条件时，判定转基因抗虫棉花Bt蛋白为高剂量表达：
2.根据权利要求1所述的一种转基因抗虫棉花Bt蛋白高剂量表达的判断方法，其特征在于，所述棉花组织为棉花苗期叶片、蕾期叶片、蕾期小蕾、铃期叶片、铃期小铃中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种转基因抗虫棉花Bt蛋白高剂量表达的判断方法，其特征在于，所述棉花组织Bt蛋白表达量使用ELISA方法测定。
4.根据权利要求1所述的一种转基因抗虫棉花Bt蛋白高剂量表达的判断方法，其特征在于，所述棉花叶片为在第2代靶标害虫发生盛期、第3代靶标害虫发生盛期、第4代靶标害虫发生盛期采集自适期播种且正常管理的棉花。
5.根据权利要求1所述的一种转基因抗虫棉花Bt蛋白高剂量表达的判断方法，其特征在于，所述靶标害虫为棉铃虫。
【技术特征摘要】
1.一种转基因抗虫棉花bt蛋白高剂量表达的判断方法，其特征在于，当转基因抗虫棉花同时满足下列条件时，判定转基因抗虫棉花bt蛋白为高剂量表达：
2.根据权利要求1所述的一种转基因抗虫棉花bt蛋白高剂量表达的判断方法，其特征在于，所述棉花组织为棉花苗期叶片、蕾期叶片、蕾期小蕾、铃期叶片、铃期小铃中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种转基因抗虫棉花bt蛋白高剂量表达的判断方...
【专利技术属性】
技术研发人员：李东阳，张开心，朱香镇，王丽，姬继超，高雪珂，雒珺瑜，崔金杰，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：
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