【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫生物，尤其涉及一种鹌鹑cenp-a多克隆抗体制备方法和应用。
技术介绍
1、众所周知，有丝分裂是真核细胞增殖的主要方式，细胞通过有丝分裂将复制的遗传物质均等地分配至子代细胞。该过程主要通过着丝粒(centromere)组建动粒(kinetochore)完成。着丝粒是染色体的主缢痕，即将染色体的较细部位，动粒则被定义为能够使着丝粒dna附着纺锤丝的蛋白质结构。动粒通过介导染色体和纺锤丝之间的相互作用，使分裂期染色体迁移。在电镜观察下动粒呈3层圆盘状结构。即内层、中间层和外层。外层动粒用于和微管发生作用，中间层动粒主要作为联系内外两层结构的桥梁。内层动粒是染色质的特化层，由着丝粒染色质和基本蛋白质组成，在细胞周期中一直与着丝粒dna相连。
2、cenp-a是在动物体内特异表达的着丝粒特异性蛋白质，相对分子质量为17kda。与其他组蛋白相比，cenp-a的保守性较低。研究表明，即使在相似物种的cenp-a组蛋白c端折叠中也存在差异，因此比较各物种cenp-a之间的差异一直被认为是解析着丝粒表观遗传调控机制的基础。鉴于cenp-a相对特异性，目前尚无专用于检测鹌鹑cenp-a蛋白的商用抗体，其他物种的抗体因同源性问题无法用于深度测序，因此进一步进行相关更深层次的功能挖掘较为困难。
3、此外，除了参与正常细胞分裂，cenp-a也被证实与癌症细胞的发生、发展、侵袭、转移及预后等过程息息相关，因此开发鹌鹑cenp-a抗体对于开展禽类相关疾病预测以及治疗靶点具有重要的现实意义。
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1、专利技术目的：为了解决上述技术问题，本专利技术旨在提供一种鹌鹑cenp-a多克隆抗体的制备方法，解决了鹌鹑cenp-a测序特异性抗体的缺乏的问题，并为后续鹌鹑cenp-a基因的功能验证提供重要工具。
2、本专利技术还提供了一种鹌鹑cenp-a多克隆抗体在用于cut&tag测序中的应用，所述用于cut&tag测序的鹌鹑cenp-a抗体，填补了鹌鹑商品化cenp-a抗体的空白，也是进一步构建鹌鹑基因组完整图谱的重要基础工作。
3、技术方案：为了实现上述目的，本专利技术所述一种鹌鹑cenp-a多克隆抗体制备方法，包括如下步骤：
4、(1)构建含有如seq id no.1所示cenp-a目的基因片段的重组表达载体；
5、(2)将重组表达载体转化至感受态细胞并诱导表达融合蛋白，收集并纯化后得到cenp-a重组蛋白；
6、(3)将cenp-a重组蛋白作为抗原进行动物免疫处理，收集血清抗体作为cenp-a多克隆抗体。
7、进一步地，步骤(1)所述seq id no.1所示的cenp-a目的基因片段重组于pet22b载体的双酶切位点之间。
8、进一步地，步骤(2)所述诱导表达融合蛋白的方法为：将构建的重组表达菌株挑取至lb液体培养基中培养，至菌液浓度od600为0.6-0.8后加入iptg培养，诱导融合蛋白表达16-18h。
9、进一步地，步骤(3)所述免疫处理的动物为小鼠。
10、进一步地，步骤(3)所述动物免疫处理方法为：取纯化好的cenp-a重组蛋白与弗氏佐剂进行乳化，注射入试验动物体内，经过6次免疫，最后一次终免70天后采集试验动物血清，收集血清即得抗血清。
11、进一步地，所述纯化好的cenp-a重组蛋白与弗氏佐剂体积相同，初免使用弗氏完全佐剂，加免使用弗氏不完全佐剂。
12、本专利技术所述一种鹌鹑cenp-a多克隆抗体是通过所述鹌鹑cenp-a多克隆抗体制备方法制得。
13、本专利技术所述鹌鹑cenp-a多克隆抗体在用于鹌鹑cut&tag测序以及检测鹌鹑组织内的cenp-a蛋白表达水平中的应用。
14、进一步地，所述应用包括如下步骤：
15、(1)取鹌鹑组织样品，对组织裂解，获得细胞核悬液，取细胞核与磁珠体系结合；
16、(2)结合后的细胞核依次进行一抗孵育、二抗孵育和和pag-tn5转座酶孵育后，进行dna片段化；
17、(3)对回收转座产物进行pcr扩增，进行测序，构建文库；
18、(4)对构建的文库进行质控、比对、分析。
19、作为优选，所述应用包括如下步骤：
20、(1)取鹌鹑组织样品，用细胞核裂解液对组织裂解，获得细胞核悬液，取10万细胞核与磁珠体系结合；
21、(2)细胞核依次进行一抗孵育、二抗孵育和和pag-tn5转座酶孵育后，进行dna片段化；
22、(3)用含有nebnext high-fidelity 2x pcr master mix和适配测序接头引物的体系对回收转座产物进行pcr扩增，采用illumina novaseq 6000进行测序，构建文库；
23、(4)测序文库片段筛选，文库浓度与片段分布检测。
24、进一步地，所述步骤(1)组织为鹌鹑卵巢组织。
25、本专利技术所述的多克隆抗体在检测鹌鹑组织中cenp-a蛋白表达中的应用。
26、本专利技术开发用于cut&tag测序的鹌鹑cenp-a抗体，填补了鹌鹑商品化cenp-a抗体的空白，也为进一步构建鹌鹑基因组完整图谱提供帮助。此外，除了参与正常细胞分裂，cenp-a也被证实与癌症细胞的发生、发展、侵袭、转移及预后等过程息息相关，因此开发鹌鹑cenp-a抗体对于开展禽类相关疾病预测以及治疗靶点具有重要的现实意义。
27、本专利技术提供了一种可用于cut&tag测序的鹌鹑cenp-a抗体制备方法和应用，可以快速、准确的检测鹌鹑组织内的cenp-a蛋白表达水平，并可用于cut&tag测序。此外，本专利技术首次提出了seq id no.1所示的基因序列在制备用于cut&tag测序以及检测鹌鹑组织内的cenp-a蛋白表达水平的鹌鹑cenp-a抗体中应用。
28、有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下显著优点：
29、本专利技术提供了一种鹌鹑cenp-a多克隆抗体制备方法和应用，可用于wb检测和cut&tag测序，多克隆抗体制作过程操作简便且结果可靠，填补了鹌鹑cenp-a多克隆抗体的空白，可为更深层的研究鹌鹑着丝粒表观遗传调控、着丝粒相关的疾病机制提供便捷，也为后续分析鸟类等脊椎动物的着丝粒结构和进化过程、揭示着丝粒相关基因如何在不同物种间演化过程提供基础支撑。
30、本方法制备的鹌鹑cenp-a多克隆抗体效价高，灵敏度高，能特异识别出鹌鹑卵巢组织cenp-a。
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1.一种鹌鹑CENP-A多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述鹌鹑CENP-A多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述SEQ ID NO.1所示的CENP-A目的基因片段重组于pet22b载体的双酶切位点之间。
3.根据权利要求1所述鹌鹑CENP-A多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述诱导表达融合蛋白的方法为：将构建的重组表达菌株挑取至LB液体培养基中培养，至菌液浓度OD 600为0.6-0.8后加入IPTG培养，诱导融合蛋白表达16-18h。
4.根据权利要求1所述鹌鹑CENP-A多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述动物免疫处理方法为：取纯化好的CENP-A重组蛋白与弗氏佐剂进行乳化，注射入试验动物体内，经过6次免疫，最后一次终免70天后采集试验动物血清，收集血清即得抗血清。
5.根据权利要求4所述鹌鹑CENP-A多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述纯化好的CENP-A重组蛋白与弗氏佐剂体积相同，初免使用弗氏完全佐剂，加免使用弗氏不完全佐剂。
6.一种
7.一种权利要求6所述鹌鹑CENP-A多克隆抗体在用于鹌鹑CUT&Tag测序以及检测鹌鹑组织内的CENP-A蛋白表达水平中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，步骤(1)所述组织为鹌鹑卵巢组织。
10.一种SEQ ID NO.1所示的基因序列在制备用于CUT&Tag测序以及检测鹌鹑组织内CENP-A蛋白表达水平的鹌鹑CENP-A抗体中应用。
...【技术特征摘要】
1.一种鹌鹑cenp-a多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述鹌鹑cenp-a多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述seq id no.1所示的cenp-a目的基因片段重组于pet22b载体的双酶切位点之间。
3.根据权利要求1所述鹌鹑cenp-a多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述诱导表达融合蛋白的方法为：将构建的重组表达菌株挑取至lb液体培养基中培养，至菌液浓度od 600为0.6-0.8后加入iptg培养，诱导融合蛋白表达16-18h。
4.根据权利要求1所述鹌鹑cenp-a多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述动物免疫处理方法为：取纯化好的cenp-a重组蛋白与弗氏佐剂进行乳化，注射入试验动物体内，经过6次免疫，最后一次终免70天后采集试验动物血清，收集血清即得抗血清。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：白皓，庄重，郭其新，陈世豪，常国斌，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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