【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶活检测，具体涉及一种检测植物alkbh酶活的方法和应用。
技术介绍
1、alkbh酶属于fe(ii)-α-酮戊二酸依赖的双加氧酶家族，能够修复基因组中dna与rna的甲基化损伤，从而影响植物基因组的完整性和稳定性。拟南芥中alkbh2蛋白的研究表明该蛋白具有能够修复寡核苷酸甲基化损伤的活性，同时在该基因突变缺失的情况下植株表现出对mms(烷基化试剂)的敏感性，比如生长出现畸形，缓慢，种子萌发率低等表型。alkbh蛋白可以利用分子氧，氧化烷基化损伤的核酸碱基上的烷基，如1-甲基腺嘌呤(m1a)、3-甲基胞嘧啶(m3c)和1-n6-乙烯腺嘌呤(εa)；氧化的烷基随后被释放为醛，再生成未损坏的碱基。因此，研究alkbh酶的活性对植物生长发育与代谢调控研究具有重要意义。然而，目前检测alkb酶活性，都是采用32’磷标记法，同位素标记法需要特殊的显示仪器，以及具有一定的辐射性，对人体具有一定的危害，且该方法需要特殊的操作室，操作过程复杂。因此，提供一种没有辐射性且操作简单的alkbh酶活检测方法显得尤为重要。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种检测植物alkbh酶活的方法和应用，本专利技术的方法安全性高，可有效检测植物中alkbh酶的活性。
2、本专利技术提供了一种检测植物alkbh酶活的方法，包括以下步骤：
3、利用表达系统表达并纯化得到重组alkbh蛋白；
4、将所述重组alkbh蛋白与核酸分子底物进行孵育，孵育后进行酶切，
5、将所述酶切产物进行电泳迁移和核酸蛋白互作分析，根据图像的条带数量和条带清晰度表征植物alkbh酶活。
6、作为一种优选方案，所述核酸分子底物包括单链dna底物和双链dna底物；当所述核酸分子底物为双链dna底物时，所述双链dna底物由正义链和反义链两条反向互补的单链退火形成。
7、作为一种优选方案，所述孵育的体系以50μl计，包括：50mm tris-hcl、2mm l-抗坏血酸、40μm feso4、100μm 2-氧戊二酸二甲酯、10mm mgcl2、1μm双链dna底物、12～90pmalkbh蛋白和余量的水。
8、作为一种优选方案，所述孵育的温度为36℃～38℃；所述孵育的时间为30min～60min。
9、作为一种优选方案，所述酶切选用的限制性内切酶为对甲基化位点敏感的限制性内切酶。
10、作为一种优选方案，所述酶切的温度为36℃～38℃；所述酶切的时间为30min～60min。
11、作为一种优选方案，所述电泳迁移使用的凝胶为15～20％的变性sds-page凝胶；所述电泳迁移的电压为100v～120v；所述电泳迁移的时间为35min～45min。
12、本专利技术还提供了检测植物alkbh酶活的方法在制备检测植物alkbh酶活产品和/或试剂盒中的应用。
13、本专利技术还提供了一种检测植物alkbh酶活的试剂盒，所述试剂盒包括核酸分子底物和核酸蛋白互作显色试剂。
14、作为一种优选方案，所述核酸分子底物的酶切位点上带有甲基化损伤；所述核酸分子底物的5’端带有生物素标签。
15、有益效果：本专利技术提供了一种检测植物alkbh酶活的方法，所述检测植物alkbh酶活的方法，包括以下步骤：利用表达系统表达并纯化得到重组alkbh蛋白；将重组alkbh蛋白与核酸分子底物进行孵育，孵育后进行酶切，酶切后得到酶切产物；将酶切产物进行电泳迁移和核酸蛋白互作分析，根据图像的条带数量和条带清晰度表征植物alkbh酶活。本专利技术所述核酸分子底物中带有甲基化损伤，在使用alkbh酶与底物共同孵育后，如果alkbh酶对于底物中的甲基化具有修复作用，那么限制性内切酶会将该底物进行酶切，形成两个片段，显示两条带。如果alkbh酶对于底物中的甲基化不具有修复作用，那么该底物将不会被切开，显示一条带。同时本专利技术中设计的底物带有生物素标签，本专利技术的化学发光核酸检测模块试剂盒，可以通过生物素标记的核酸与辣根过氧化物酶(hrp)偶联，从而达到对生物素标记的核酸进行检测的目的。相较于之前使用的同位素放射性磷标记法，更为方便快捷以及安全。本专利技术的方法，可有效检测植物中alkbh酶的活性，可作为一种适用范围广、实用性强、高稳定性的植物alkbh酶活的检测方法。
16、本专利技术所应用的化学发光核酸检测模块试剂盒包括用于辣根过氧化物酶(hrp)的增强型鲁米诺底物，现有技术检测alkbh酶活性时，都是采用32’磷标记法，同位素标记法需要特殊的显示仪器，以及具有一定的辐射性，对人体具有一定的危害。在本专利技术实验中由于设计的底物是带有生物素标签的，因此可以通过辣根过氧化物酶(hrp)偶联物进行探测。化学发光核酸检测模块试剂盒相较于之前使用的同位素放射性磷标记法，更为方便快捷以及安全。本专利技术的方法安全性高，操作简单，对植物生长发育与代谢调控研究具有重要意义，实用性强，具有较大的应用价值。
17、本专利技术的方法检测alkbh酶活具有适用范围广、易操作、高效率、高稳定性的优点，使用该方法检测酶活性的过程中，生物素标记不易降解，可稳定进行化学发光，为检测alkbh酶活提供了更有效的方法和途径。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种检测植物ALKBH酶活的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸分子底物包括单链DNA底物和双链DNA底物；当所述核酸分子底物为双链DNA底物时，所述双链DNA底物由正义链和反义链两条反向互补的单链退火形成。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述孵育的体系以50μL计，包括：50mMTris-HCl、2mM L-抗坏血酸、40μM FeSO4、100μM 2-氧戊二酸二甲酯、10mM MgCl2、1μM双链DNA底物、12～90pMALKBH蛋白和余量的水。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述孵育的温度为36℃～38℃；所述孵育的时间为30min～60min。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶切选用的限制性内切酶为对甲基化位点敏感的限制性内切酶。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶切的温度为36℃～38℃；所述酶切的时间为30min～60min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述电泳迁移使用的
8.权利要求1～7任一项所述的方法在制备检测植物ALKBH酶活产品和/或试剂盒中的应用。
9.一种检测植物ALKBH酶活的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸分子底物和核酸蛋白互作显色试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸分子底物的酶切位点上带有甲基化损伤；所述核酸分子底物的5’端带有生物素标签。
...【技术特征摘要】
1.一种检测植物alkbh酶活的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸分子底物包括单链dna底物和双链dna底物；当所述核酸分子底物为双链dna底物时，所述双链dna底物由正义链和反义链两条反向互补的单链退火形成。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述孵育的体系以50μl计，包括：50mmtris-hcl、2mm l-抗坏血酸、40μm feso4、100μm 2-氧戊二酸二甲酯、10mm mgcl2、1μm双链dna底物、12～90pmalkbh蛋白和余量的水。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述孵育的温度为36℃～38℃；所述孵育的时间为30min～60min。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶切选用...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。