【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病原检测，具体涉及一种检测家蚕核型多角体病毒的引物对、试剂盒和检测方法。
技术介绍
1、家蚕核型多角体病也被称为血液型脓病，是蚕业生产上最为严重的病毒性传染病，其病原为家蚕核型多角体病毒(bombyx morinuclearpolyhedrosis virus，bmnpv)。bmnpv有两种完全不同的病毒粒子表型：即出芽型的病毒粒子(芽生病毒，buddedvirus,bv)和包涵体衍生性病毒粒子(包涵体病毒，occlusion-derivedvirus,odv)。芽生病毒主要在杆状病毒侵染早期形成，主要介导细胞间的全身系统性感染，包涵体病毒则主要在病毒感染晚期，由大量蛋白将病毒粒子包裹而形成，对包埋在其中的病毒粒子有非常好的保护作用，在光学显微镜下可以清晰的观察到其形状为六角形且具有一定的折光性。bmnpv具有较强的传染性，主要通过水平传播感染幼虫，影响范围广，且其感染家蚕后病程较短，蔓延迅速，具有明显病症时已是发病晚期，难以挽回，常造成蚕业生产严重减产甚至绝收，严重影响蚕桑产业效益及可持续发展。据报道，每年全国蚕桑生产过程中因蚕病造成的损失占总产量的30％，其中70％是由bmnpv感染引起。在蚕业生产中暂无有效治愈方法，主要通过早期发现并淘汰病蚕、消杀蚕座等方式来避免家蚕核型多角体病的大面积爆发，挽回部分经济损失。因此，建立灵敏、快速、稳定且操作简单的高通量检测方法对阻止家蚕核型多角体病在家蚕养殖过程中大面积爆发以及精准实施养蚕环境中bmnpv的消杀极为重要。
2、目前bmnpv常用的检测方法有肉眼检
3、环介导等温扩增(lamp)及重组酶聚合酶扩增(rpa)技术结合核酸侧向层析试纸的检测方法，反应灵敏且可在常温下进行扩增，但lamp和rpa在非实验室条件下极易发生交叉污染，造成假阳性，难以在生产中大面积推广。crispr/cas13a检测，反应灵敏，特异性高，但该方法对检测人员要求较高，所需试剂耗材成本也较高。荧光定量pcr染料法检测，虽然反应灵敏且成本低，但是特异性较差，容易造成假阳性结果。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种检测家蚕核型多角体病毒的引物对、试剂盒和检测方法，为家蚕养殖过程中bmnpv的早期诊断及养蚕环境精准消杀提供可靠方法。
2、本专利技术提供了一种检测家蚕核型多角体病毒的引物对，所述引物对针对家蚕核型多角体病毒的保守基因gp64设计得到。
3、本专利技术一种优选方式中，包括核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物qnpvgp64-183f和seq id no.2所示的下游引物qnpvgp64-183r。
4、本专利技术一种优选方式中，还包括核苷酸序列如seq id no.3所示的探针。
5、本专利技术一种优选方式中，在所述探针的5’端标记荧光基团，在3’端标记淬灭基团。
6、本专利技术还提供了一种检测家蚕核型多角体病毒的试剂盒，包括上述引物对和用于qpcr扩增的试剂。
7、本专利技术还提供了上述引物对或上述试剂盒在检测家蚕核型多角体病毒中的应用。
8、本专利技术还提供了一种检测家蚕核型多角体病毒的方法，包括以下步骤：提取样本基因组dna为模板，与上述引物对或上述试剂盒中的引物对和探针配置qpcr体系，并进行qpcr扩增，当样品的扩增结果有特异性扩增曲线且ct值≤38时，判定为阳性；当样品的扩增结果无特异性扩增曲线或无ct值时，判定为阴性；当样品的扩增结果有特异性扩增曲线且38＜ct值≤40时，判定为阳性可疑样本，需进行复检。
9、本专利技术一种优选方式中，所述样本基因组dna取自以下至少一种：病蛹、病蚕幼虫、病卵和养蚕环境。
10、本专利技术一种优选方式中，所述qpcr体系以10μl计，包括：探针0.1μl，上下游引物各0.2μl，反应液7.5μl和模板2μl。
11、本专利技术一种优选方式中，所述qpcr扩增的反应程序，包括：37℃2min；95℃30s；95℃10s，60℃30s采集荧光，40个循环。
12、有益效果：本专利技术选取bmnpv高度保守基因gp64作为检测靶标，设计得到可用于bmnpv特异性检测的引物对qnpvgp64-183f和qnpvgp64-183r，其核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示。
13、本专利技术还基于qpcr建立bmnpv快速检测方法，并设计了核苷酸序列如seq id no.3所示的特异性探针pnpvgp64-183，所述检测方法以蚕业生产中常见病原基因组dna为模板，结果显示该引物和探针只可特异性检测bmnpv，可用于bmnpv特异性检测；对阳性标准质粒的检测灵敏度可达0.85copies/μl，对bmnpv基因组的检测灵敏度可达2fg/μl，灵敏度高。本专利技术基于所述引物和探针建立的bmnpv荧光定量pcr检测方法，特异性好、灵敏度高且操作简单，所需仪器少，可用于家蚕感染早期和养蚕环境中bmnpv的特异性检测，不仅可在蚕业中快速推广使用，还可实现对bmnpv的高灵敏、高通量早期检测，实现核型多角体病的早期诊断，对减少因家蚕核型多角体病给蚕茧及蚕种生产造成的经济损失，推动蚕桑产业绿色健康发展具有重要意义。
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1.一种检测家蚕核型多角体病毒的引物对，其特征在于，所述引物对针对家蚕核型多角体病毒的保守基因GP64设计得到。
2.根据权利要求1所述引物对，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的上游引物qNPVgp64-183F和SEQ ID No.2所示的下游引物qNPVgp64-183R。
3.根据权利要求1或2所述引物对，其特征在于，还包括核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的探针。
4.根据权利要求3所述引物对，其特征在于，在所述探针的5’端标记荧光基团，在3’端标记淬灭基团。
5.一种检测家蚕核型多角体病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4所述引物对和用于qPCR扩增的试剂。
6.权利要求1～4任一项所述引物对或权利要求5所述试剂盒在检测家蚕核型多角体病毒中的应用。
7.一种检测家蚕核型多角体病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取样本基因组DNA为模板，与权利要求1～4任一项所述引物对或权利要求5所述试剂盒中的引物对和探针配置qPCR体系，并进行qPCR扩增，当样品的扩增结果有特异
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述样本基因组DNA取自以下至少一种：病蛹、病蚕幼虫、病卵和养蚕环境。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述qPCR体系以10μL计，包括：探针0.1μL，上下游引物各0.2μL，反应液7.5μL和模板2μL。
10.根据权利要求7或9所述方法，其特征在于，所述qPCR扩增的反应程序，包括：37℃2min；95℃30s；95℃10s，60℃30s采集荧光，40个循环。
...【技术特征摘要】
1.一种检测家蚕核型多角体病毒的引物对，其特征在于，所述引物对针对家蚕核型多角体病毒的保守基因gp64设计得到。
2.根据权利要求1所述引物对，其特征在于，包括核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物qnpvgp64-183f和seq id no.2所示的下游引物qnpvgp64-183r。
3.根据权利要求1或2所述引物对，其特征在于，还包括核苷酸序列如seq id no.3所示的探针。
4.根据权利要求3所述引物对，其特征在于，在所述探针的5’端标记荧光基团，在3’端标记淬灭基团。
5.一种检测家蚕核型多角体病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4所述引物对和用于qpcr扩增的试剂。
6.权利要求1～4任一项所述引物对或权利要求5所述试剂盒在检测家蚕核型多角体病毒中的应用。
7.一种检测家蚕核型多角体病毒的方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟宪志，解芳丽，何章帅，潘国庆，陈洁，周泽扬，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：
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