【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于钳形dna支架和空间局域协同催化发卡自组装策略检测mir-21的方法。
技术介绍
1、微小rna(mirna)是一类分布十分广泛的内源性非编码rna,在动物、植物和病毒中广泛存在。mirna与肿瘤的发生、发展和愈后有关,并在肿瘤的增殖、分化及凋亡等方面有重要的作用。大量研究结果表明,许多mirna可作为原癌基因或抑癌基因,在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用,其中mir-21最受重视。mir-21作为较早发现的人类mirna之一,因其较为明确的存在背景,而成为人类mirna功能研究中的重要工具。研究发现mir-21在人类卵巢癌组织中异常表达，mir-21可能通过抑制pten蛋白的表达发挥其癌基因的作用。血清中mir-21表达水平对妇科肿瘤如卵巢肿瘤和子宫肿瘤诊断具有重要的参考价值。目前，常见的mirna检测方法rt-qpcr、northernblot和微阵列被广泛用于检测mirna。灵敏度的提高有利于检测mirna信号。然而，一些明显的缺点阻碍了它们的使用，例如处理时间长、操作过程繁琐和假阳性结果高。因此，简化mirna检测过程并缩短检测时间的新策略值得探索。
2、基于适配体的dna纳米技术因其独特的优点而受到广泛关注，包括结合亲和力强、易于使用、易于化学合成、生物相容性好和成本低。适配体是一个小的寡核苷酸序列，是通过指数富集(selex)的系统进化过程来选择的。它通过氢键和疏水相互作用对其目标物具有很强的亲和力。因此，它被广泛应用于金属离子、小分子和蛋白质等物质的检测。尽管这些方法具有其优点，但灵
3、传统的基于dna的扩增策略具有单一的催化位点，导致碰撞反应概率低，相互作用效率低，限制了反应动力学和灵敏度。为了克服这一缺点，空间局域策略已成为一种很有吸引力的方法，它可以在dna纳米结构上组装多个催化位点，以增加催化剂浓度，加速反应。因此，设计具有空间局域性提高催化剂浓度和反应物的双空间局域策略对提高放大能力和缩短反应时间具有重要意义。
4、为解决现有技术中的问题，本专利技术提出一种基于钳形dna支架和空间局域协同催化发卡自组装策略检测mir-21的方法。
技术实现思路
1、为解决现有技术中的问题，本专利技术提出了一种空间局域协同的催化发卡自组装策略用于mir-21检测。mir-21可以诱导初级催化发卡自组装反应产生三足y型dna。三足y型dna的三个末端能够催化金纳米粒子上的钳形dna支架发生催化发卡自组装反应。同时，因为三个尾端在空间上的距离较近，这大大增加了二级催化发卡自组装催化剂的局部浓度。此外，金纳米粒子上的钳形dna支架具有紧密靠近的两对分子发卡，以增加二级催化发卡自组装反应物的浓度。通过这种空间约束的设计，有效浓度大大提高。将两个级别催化发卡自组装的反应时间缩短至40min，检测限低至0.1pm。此外，空间局域协同的催化发卡自组装策略在疾病诊断和监测方面具有良好的实际应用能力和广泛的应用前景。
2、具体来讲，本专利技术提供了一种基于钳形dna支架和空间局域协同催化发卡自组装策略检测mir-21的方法。包括如下步骤：
3、1、一种基于钳形dna支架和空间局域协同催化发卡自组装策略检测mir-21的方法。包括如下步骤：
4、1)将序列s1、s2、s3、s4、h4和h5以相同的摩尔比溶解在pbs缓冲液中形成钳形dna支架。然后将生成的钳形dna支架与金纳米粒子反应12小时，固定到金纳米粒子上。其中s1序列为5’-gaatgctgcgtgtaatccgtctgtccactggctactgtc-3’，s2序列为5’-gagtactagaggaacacgcagcattcacctgtctgtcgt-3’，s3序列为5’-ggac agacggatttcctctagtactcctgtgtgactcca-3’，s4序列为5’-hs-ttttttttttt ttttttttttggagtcacaca-3’，h4序列为5’-cgatccaatctacagcagatgtgtacc gctgtagattggatcggtccttgattttttttgacagtagccagt-3’，h5序列为5’-fam(荧光素)-agatgtgtacccgatccaatctacagcggtacacatct(bhq1/淬灭剂)gctgt agattttttttttacgacagacaggt-3’。
5、2)将待测mir-21样品与相同摩尔比的序列h1、h2和h3混合，加入到步骤1所得溶液中。其中mir-21序列为5’-uagcuuaucagacugauguuga-3’，h1序列为5’-tcaa ggaccgatattgtcaacatcagtctgataagctacaatcaactagcttatcagactgac caatctacagc-3’，h2序列为5’-tcaaggaccgattcagtctgataagctagttgattg gactgatgttgacaatcaactagctccaatctacagc-3’，h3序列为5’-tcaaggaccg atagctagttgattgtcaacatcagtctagcttatcagactgatgttgacaatccaatct acagc。
6、3)检测步骤2所得溶液的荧光光谱，用标准曲线法得出待测样品中mir-21浓度。
7、优选的，步骤1)具体为：h4和h5提前加热到90℃再缓慢降至室温，形成核酸分子发卡结构。再将等摩尔量的序列s1、s2、s3、s4、h4和h5溶解在10mm pbs缓冲溶液(100mm nacl，ph 7.4)中，然后在37℃下孵育60分钟，形成钳形dna支架，然后加入10nm的金纳米粒子反应12小时，将钳形dna支架固定到金纳米粒子表面。
8、优选的，步骤2)具体为：将样品mir-21与以1：1：1摩尔比的h1、h2和h3混合加入到步骤1所得溶液中，在37℃下混合孵育40min。以形成三足y型dna结构及与溶液中的金纳米粒子上的钳形dna支架发生催化发卡自组装反应。
9、优选的，步骤3)具体为：荧光光谱在486nm激发，发射光谱在505-600nm扫描。用标准曲线法得出待测样品中mir-21浓度。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种基于钳形DNA支架和空间局域协同催化发卡自组装策略检测miR-21的方法。包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)具体为：H4和H5提前加热到90℃再缓慢降至室温，形成核酸分子发卡结构。再将等摩尔量的序列S1、S2、S3、S4、H4和H5溶解在10mMPBS缓冲溶液(100mMNaCl，pH 7.4)中，然后在37℃下孵育60分钟，形成钳形DNA支架，然后加入10nM的金纳米粒子反应12小时，将钳形DNA支架固定到金纳米粒子表面。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)具体为：将样品miR-21与以1：1：1摩尔比的H1、H2和H3混合加入到步骤1所得溶液中，在37℃下混合孵育40min。以形成三足Y型DNA结构及与溶液中的固定到金纳米粒子上的钳形DNA支架发生催化发卡自组装反应。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)具体为：荧光光谱在486nm激发，发射光谱在505-600nm扫描。用标准曲线法得出待测样品中miR-21浓度。
【技术特征摘要】
1.一种基于钳形dna支架和空间局域协同催化发卡自组装策略检测mir-21的方法。包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)具体为：h4和h5提前加热到90℃再缓慢降至室温，形成核酸分子发卡结构。再将等摩尔量的序列s1、s2、s3、s4、h4和h5溶解在10mmpbs缓冲溶液(100mmnacl，ph 7.4)中，然后在37℃下孵育60分钟，形成钳形dna支架，然后加入10nm的金纳米粒子反应12小时，将钳形dna支架固定到金...
【专利技术属性】
技术研发人员：马蓉，李燕，曼热帕，王静，梁凌云，
申请(专利权)人：新疆医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。