【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业，尤其是一种谷物镰孢菌的田间检测试剂盒及应用。
技术介绍
1、在小麦、玉米和水稻上的腐病和枯萎病病害调查显示，镰孢菌属病害的占比达70％-95％，且多以病原复合体形式存在。其中，产毒菌种拟轮枝镰孢菌fusariumverticillioides和禾谷镰孢菌f.graminearum为优势病原菌。这些真菌会导致作物的腐烂和枯萎，造成经济损失和粮食短缺。它们产生的有害真菌毒素伏马毒素、脱氧雪腐镰孢菌烯醇(又称呕吐毒素)、玉米赤霉烯酮和尼伏毒素对牲畜和人类的健康构成了重大威胁。鉴于其广泛存在和有害影响，对这些镰孢菌进行快速田间筛查，对有效管理和减轻其危害、确保食品安全和农业生产力至关重要。
2、由于不同种的镰孢菌在形态上相似且易受环境影响，传统的形态学鉴定方法难以准确鉴别，而基于分子生物学技术的鉴定方法如聚合酶链式反应(pcr)和实时荧光定量pcr因其能够扩增特定序列而可准确鉴定到种。基于pcr的技术虽然具有高灵敏度和特异性，因为需要精确的温控设备和熟练的操作，但在现场检测中仍面临挑战。为了解决这一限制，等温扩增技术，如环介导等温扩增(lamp)、重组酶聚合酶扩增(rpa)等核酸扩增方法被开发出来，简化了检测过程并缩短了时间，逐渐取代pcr法。与lamp相比，rpa具有更快的扩增速度、更低的操作温度和更简单的操作设置，使其更适合用于现场快速核酸鉴定。最近，一种改进的rpa版本——重组酶辅助扩增(raa)已经被开发出来。与rpa系统类似，raa依赖于重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶。raa检测在30min
3、基于成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)/crispr相关蛋白(cas)系统的可视化核酸检测方法因其快速、便携、低成本和高度灵敏的检测能力，尤其在资源有限的环境中，受到了广泛关注。在crispr效应因子中，cas12a能够在单向导rna(crrna)的引导下结合并切割目标双链dna(dsdna)，并在结合目标后表现出非特异性单链dna(ssdna)切割活性而脱颖而出。利用这一特性，采用带有荧光基团、黑洞淬灭剂或生物素标记的ssdna报告探针，即可实现通过荧光信号或胶体金试纸条判定目标dna的存在的目的。
4、raa扩增结合crispr/cas12a技术具有原位、精准、快速、可视等优点，在医学即时检测方面已广泛应用，但在农业上研究较少，鲜有采用raa联合crispr/cas12a检测镰孢菌的报道。此技术的构建与应用可提升田间对拟轮枝镰孢菌和禾谷镰孢菌检测结果的精确度和可信度。
5、目前，现有技术中基于pcr的拟轮枝镰孢菌和禾谷镰孢菌分子鉴定技术是利用dna聚合酶和特异性pcr引物对，在含有核苷酸的反应缓冲液中，对菌株基因组gdna特异性扩增。扩增反应包括变性(将反应体系加热至94℃-98℃，使dna双链解开，产生两条单链模板)，退火(降低温度至50℃-65℃，使引物能够与目标dna序列互补结合，形成引物-模板复合物)，延伸(提高温度至dna聚合酶的最适工作温度92℃，dna聚合酶沿着引物-模板复合物合成新的dna链)，重复上述三个步骤(变性、退火、延伸)20-40次，使目标dna序列得以指数级扩增，最终保持在延伸温度一段时间，确保最后一轮pcr中所有未完成的dna链得到完全延伸。通过这些步骤，pcr能够从极小的基因组gdna样本中扩增出足够数量的目标dna片段，为进一步检测或测序提供了充足的核酸材料。但是，其具有如下缺陷：(1)对基因组gdna样本量和纯度要求高；(2)依赖于价格昂贵的温控仪器，无法在田间完成检测，检测成本高；(3)基因组gdna的提取和纯化需0.5h-1.0h，pcr反应需1.5h-2.0h，结果的凝胶电泳成像需0.5h-1.0h，共计2.5h-4.0h，实验步骤繁琐，周期长。
6、专利文献cn202310860222公开基于拟轮枝镰孢的伏马毒素基因序列的rpa-crispr/cas12a检测技术，利用t4噬菌体的核酸复制机制，在多种酶和蛋白质的共同作用下，可以在简单热源(37℃-43℃)的辅助下于30min内完成靶标基因的扩增。通过crisprcas12a靶向识别和切割靶标基因(双链dna)的dna酶活性完成对靶标基因单碱基级别的高特异性识别。cas12a在靶向切割双链dna后受激获得切割非靶标单链dna的活性。其具有如下缺陷：(1)针对拟轮枝镰孢菌的伏马毒素基因序列的检测，无法鉴定不生产伏马毒素的菌株。此外，拟轮枝镰孢菌还可能具备分泌脱氧雪腐镰孢菌烯醇、玉米赤霉烯酮和伏生毒素等对人类和动物健康有潜在危害的真菌毒素。因此，仅针对伏马毒素基因序列的检测仍然存在食品安全隐患。(2)此技术基于核酸提取液的核酸提取，增加了成本；(3)此技术选用的rpa等温扩增技术是英国twistdx公司开发的，进口试剂的使用增加了检测成本,而我们选用的raa等温扩增技术是由中国团队开发的rpa的升级版，在保留了rpa的所有技术优势的同时更具成本效益；(4)此技术仅限于基于试纸条检测的终点法检测，缺乏灵活性，即在遇到感染量多的样品时仍需等待实验全程的完毕，而在遇到感染量少的样品时也无法通过延长反应时间提升检测的灵敏性。
7、另外cn202311209620、cn116926235b、cn202311209639公开基于rpa-crispr/cas系统检测拟轮枝镰孢菌或禾谷镰孢菌的方法；利用t4噬菌体的核酸复制机制，在多种酶和蛋白质的共同作用下，可以在简单热源(37℃-42℃)的辅助下于10min-30min内完成靶标基因的扩增。通过crispr cas12a靶向识别和切割靶标基因(双链dna)的dna酶活性完成对靶标基因单碱基级别的高特异性识别。cas12a在靶向切割双链dna后受激获得切割非靶标单链dna的活性。其具有如下缺陷：(1)此技术基于离心柱法或核酸提取液的核酸提取技术，增加了成本；(2)此技术选用的rpa等温扩增技术是英国twistdx公司开发的，进口试剂的使用增加了检测成本，而本专利技术选用的raa等温扩增技术是由中国奇天基因开发的rpa的升级版，在保留了rpa的所有技术优势的同时更具成本效益；(3)此技术需要选定特定的报告分子来完成荧光检测或试纸条检测，具体地，标记fam和biotin的报告分子用于试纸条检测，标记fam和猝灭基团的报告分子用于荧光检测，检测结果可视化手段不灵活，而本专利技术研发的技术是通过三标记报告基团，实现对同一反应体系的双重结果可视化体现，增加检测的灵活性。在不增加反应次数和成本的情况下，通过两种技术手段呈现结果，可达到对检测结果二次验证的效果。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足之处，提本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种谷物镰孢菌的田间检测试剂盒，其特征在于：包括
2.根据权利要求1所述的谷物镰孢菌的田间检测试剂盒，其特征在于：还包括构建crRNA的DNA的引物
3.根据权利要求1或2所述的谷物镰孢菌的田间检测试剂盒，其特征在于：还包括ssDNA报告分子：5’-FAM-TTATT-BHQ1-TTATT-Biotin-3’三重标记探针。
4.根据权利要求3所述的谷物镰孢菌的田间检测试剂盒，其特征在于：反应体系包括RAA反应体系和CRISPR/Cas12a反应体系；
5.一种田间检测谷物镰孢菌的方法，其特征在于：步骤如下
6.根据权利要求5所述的一种田间检测谷物镰孢菌的方法，其特征在于：所述crRNA序列二，crRNA序列一扩增引物为：
【技术特征摘要】
1.一种谷物镰孢菌的田间检测试剂盒，其特征在于：包括
2.根据权利要求1所述的谷物镰孢菌的田间检测试剂盒，其特征在于：还包括构建crrna的dna的引物
3.根据权利要求1或2所述的谷物镰孢菌的田间检测试剂盒，其特征在于：还包括ssdna报告分子：5’-fam-ttatt-bhq1-ttatt-biotin-3’三重标记...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏蘩，赵斌，刘征辉，孙萌，李秀丽，赵琳琳，赵云平，魏静娜，
申请(专利权)人：天津市农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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