【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及炎症模型体外培养领域，具体涉及一种模拟类风湿关节炎的滑膜炎体外模型及其构建方法。
技术介绍
1、类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,ra)是以侵蚀性与对称性关节病变、关节滑膜炎为特征的慢性自身免疫性疾病，临床症状以关节畸形、晨僵、手足腕踝颞颌关节炎等为主。ra的基本病理改变为滑膜炎、血管炎及血管翳的形成，并逐渐出现关节软骨和骨破坏，最终导致关节畸形和功能丧失。随着病程的延长，ra患者的残疾及功能受限发生率升高，病程≥15年的致残率高达61.3％。ra不仅造成患者身体机能和生活质量的下降，也给家庭和社会带来巨大的经济负担(参考文献1)。
2、现代医学目前认为病理上ra主要源自滑膜炎症，滑膜成纤维细胞是维持关节正常功能的组织结构，是滑膜层的最大细胞群之一，也是滑膜炎症的主要病变部位。同时，关节微环境中驻留的成纤维细胞样滑膜细胞(flss)、巨噬细胞和血管内皮细胞，也已在各种动物研究和体外试验中被认为是导致持续性关节炎的关键组织成分(参考文献2-4)。flss、巨噬细胞和内皮细胞是ra疾病发生和发展的关键因素，它们通过细胞间相互作用导致了滑膜炎进展和骨侵蚀，因此靶向抑制flss的增生和侵袭表型、恢复m1/m2型细胞的动态平衡及调节血管内皮的增生，从而促进关节炎症消退及组织修复，是ra治疗的重要方向。
3、在多种疾病研究中，2d单细胞模型并不能完全模拟人体疾病的状态，因此它们在基础研究中的应用受到质疑。在过去的十年中，关节炎研究逐渐从传统的二维细胞培养转向更复杂的三维细胞培养，这
4、既往滑膜器官芯片/滑膜类器官多以炎症因子刺激(如tnf-α)(参考文献6)，也就是说，为了保证模型的炎症状态，需要加入各种刺激因素，而这些刺激因素在后续的研究过程中就可能成为影响因素。例如，既往有文献将滑膜成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞进行共培养时，需要加入vegf/bfgf刺激因素(参考文献7)。
5、引用的参考文献
6、出版的参考文献(非专利文献)
7、1.2018中国类风湿关节炎诊疗指南中华医学会风湿病学分会[j].临床医学研究与实践,2018,3(12):201.
8、2.nygaard g,firestein g s.restoring synovial homeostasis inrheumatoid arthritis by targeting fibroblast-like synoviocytes[j].naturereviews rheumatology,2020,16(6):316-333.
9、3.rose b j,kooyman d l.a tale of two joints:the role of matrixmetalloproteases in cartilage biology[j].disease markers,2016,2016:1-7.
10、4.leblond a,allanore y,avouac j.targeting synovial neoangiogenesis inrheumatoid arthritis[j].autoimmunity reviews,2017,16(6):594-601.
11、5.pampaloni f,reynaud e g,stelzer e h k.the third dimension bridgesthe gap between cell culture and live tissue[j].nature reviews molecular cellbiology,2007,8(10):839-845.
12、6.rothbauer m,g,eilenberger c,et al.monitoring tissue-levelremodelling during inflammatory arthritis using a three-dimensional synovium-on-a-chip with non-invasive light scattering biosensing[j].lab chip.2020；20(8):1461-1471.
13、7.philippon eml,van rooijen lje,khodadust f,van hamburg jp,van derlaken cj,tas sw.a novel 3d spheroid model of rheumatoid arthritis synovialtissue incorporating fibroblasts,endothelial cells,and macrophages[j].frontimmunol.2023；14:1188835.
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供一种模拟类风湿关节炎的滑膜炎体外模型及其构建方法，以微流控芯片为载体，将滑膜成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞进行3d共培养，且共培养时无需额外添加刺激因素，通过细胞之间相互作用达到滑膜炎症状态。
2、本专利技术的第一方面提供了一种模拟类风湿关节炎的滑膜炎体外模型的构建方法，所述方法包括以下步骤：
3、步骤1、制备滑膜成纤维细胞的细胞悬液、巨噬细胞的细胞悬液和内皮细胞的细胞悬液；
4、步骤2、将步骤1中的三种细胞悬液分别与细胞外基质混合并接种于具有三通道的微流控芯片中；
5、步骤3、培养步骤2中的所述微流控芯片从而形成所述模拟滑膜炎模型。
6、进一步地，在所述步骤2中，所述微流控芯片包括中间通道和位于所述中间通道两侧的两个侧通道，将与所述细胞外基质混合后的滑膜成纤维细胞的细胞悬液接种于所述中间通道，将与所述细胞外基质混合后的巨噬细胞的细胞悬液和与所述细胞外基质混合后的所述内皮细胞的细胞悬液分别接种于所述两个侧通道。
7、进一步地，所述步骤1包括：将所述滑膜成纤维细胞、所述巨噬细胞和所述内皮细胞分别进行如下处理：采用0.25％的胰蛋白酶消化2～3分钟，随后加入含有血清的培养基终止消化，收集细胞液并进行离心，弃去上清液后加入5ml的pbs吹打清洗，再次离心后弃去上清液，加入含有85％的dmem培养基、15％的fbs和1％的ps的培养液中，由此分别获得三种细胞的细胞悬液。
8、进一步地，所述滑膜成纤维细胞的细胞悬液、巨噬细胞的细胞悬液和内皮细胞的细胞悬液中滑膜成纤维细胞、巨噬细胞以及内皮细胞的密度均为0.5×106个/ml～4×106个/ml。
9、进一步地，在所述步骤2中，三种细胞的所述细胞悬液与所述细胞外基质的比例均为1～3:1。
10、进一步地，在所述步骤2中，所接种的滑膜成纤维细胞、巨噬细胞以及内皮细胞的个数比本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种模拟类风湿关节炎的滑膜炎体外模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的模拟类风湿关节炎的滑膜炎体外模型的构建方法，其特征在于，在所述步骤2中，所述微流控芯片包括中间通道和位于所述中间通道两侧的两个侧通道，将与所述细胞外基质混合后的滑膜成纤维细胞的细胞悬液接种于所述中间通道，将与所述细胞外基质混合后的巨噬细胞的细胞悬液和与所述细胞外基质混合后的所述内皮细胞的细胞悬液分别接种于所述两个侧通道。
3.根据权利要求1或2所述的模拟类风湿关节炎的滑膜炎体外模型的构建方法，其特征在于，所述步骤1包括：将所述滑膜成纤维细胞、所述巨噬细胞和所述内皮细胞分别进行如下处理：采用0.25％的胰蛋白酶消化2～3分钟，随后加入含有血清的培养基终止消化，收集细胞液并进行离心，弃去上清液后加入5mL的PBS吹打清洗，再次离心后弃去上清液，加入含有85％的DMEM培养基、15％的FBS和1％的PS的培养液中，由此分别获得三种细胞的细胞悬液。
4.根据权利要求3所述的模拟类风湿关节炎的滑膜炎体外模型的构建方法，其特征在于，所述滑膜成纤维
5.根据权利要求3所述的模拟类风湿关节炎的滑膜炎体外模型的构建方法，其特征在于，在所述步骤2中，三种细胞的所述细胞悬液与所述细胞外基质的比例均为1～3:1。
6.根据权利要求5所述的模拟类风湿关节炎的滑膜炎体外模型的构建方法，其特征在于，在所述步骤2中，所接种的滑膜成纤维细胞、巨噬细胞以及内皮细胞的个数比为1:1:0.5～2。
7.根据权利要求5所述的模拟类风湿关节炎的滑膜炎体外模型的构建方法，其特征在于，所述细胞外基质选自以下中的一种：Matrigel、I型鼠尾胶原、纤连蛋白和甲基丙烯酰化明胶。
8.根据权利要求1或2所述的模拟类风湿关节炎的滑膜炎体外模型的构建方法，其特征在于，所述步骤3中的培养的条件为：将步骤2中的所述微流控芯片接种至含有85％的DMEM培养基、15％的FBS和1％的PS的培养液中，置于37℃、5％CO2的培养箱中进行培养。
9.一种模拟类风湿关节炎的滑膜炎体外模型，所述滑膜炎体外模型通过根据权利要求1至8任一项所述的方法进行构建。
...【技术特征摘要】
1.一种模拟类风湿关节炎的滑膜炎体外模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的模拟类风湿关节炎的滑膜炎体外模型的构建方法，其特征在于，在所述步骤2中，所述微流控芯片包括中间通道和位于所述中间通道两侧的两个侧通道，将与所述细胞外基质混合后的滑膜成纤维细胞的细胞悬液接种于所述中间通道，将与所述细胞外基质混合后的巨噬细胞的细胞悬液和与所述细胞外基质混合后的所述内皮细胞的细胞悬液分别接种于所述两个侧通道。
3.根据权利要求1或2所述的模拟类风湿关节炎的滑膜炎体外模型的构建方法，其特征在于，所述步骤1包括：将所述滑膜成纤维细胞、所述巨噬细胞和所述内皮细胞分别进行如下处理：采用0.25％的胰蛋白酶消化2～3分钟，随后加入含有血清的培养基终止消化，收集细胞液并进行离心，弃去上清液后加入5ml的pbs吹打清洗，再次离心后弃去上清液，加入含有85％的dmem培养基、15％的fbs和1％的ps的培养液中，由此分别获得三种细胞的细胞悬液。
4.根据权利要求3所述的模拟类风湿关节炎的滑膜炎体外模型的构建方法，其特征在于，所述滑膜成纤维细胞的细胞悬液、巨噬细胞的细胞悬液和内皮...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖诚，刁文雅，
申请(专利权)人：中日友好医院中日友好临床医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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