【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒的高通量，尤其涉及基于全基因组检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物组、建库方法及应用。
技术介绍
1、猪繁殖与呼吸综合征病毒（ porcine reproductive and respiratory syndrome， 简称prrs）基因1型（prrsv-1）和prrsv基因2型（prrsv-2）目前已被认为是两个不同的种，与其他15个来自灵长类、啮齿类和马属动物的病毒种同属于动脉炎病毒科（ arteriviridae)。prrsv-1和prrsv-2的原型毒株（lelystad 和 vr-2332）均于1991年左右分别在欧洲（prrsv-1）和北美(prrsv-2）被发现，其核苷酸序列的变异度约为44%。当今这两个种在世界范围内广泛分布，其中prrsv-1主要分布于欧洲，而prrsv-2则主要分布于美洲和亚洲。基于orf5的遗传演化分析显示，prrsv-1的亚型1毒株可被分为12个不同的分化枝。与prrsv-1亚型1的分群情况相对应，基于orf5基因的遗传演化分析，prrsv-2可被划分为9个不同的谱系（lineage)，其中有7个谱系的毒株主要流行于北美洲，2个谱系的毒株则仅在东亚流行。与prrsv-1不同亚型之间的演化关系相同，遗传演化分析表明prrsv-2不同谱系之间可能在北美发现prrsv-2之前就已经出现了分化。因此，很有可能在将prrs认定为一种新发猪病之前，prrsv-2已经开始了大范围的传播和演化。存在于亚洲的
2、目前，病毒检测中的核酸检测方法主要有荧光定量pcr（qpcr）、sanger测序（一代测序）和高通量测序（二代测序和纳米孔测序）。qpcr可实时监测pcr扩增过程中的荧光信号变化，实现对目标核酸的定量分析，可快速鉴定prrsv感染，适用于病毒含量的精确测定。但qpcr通常只检测特定的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因片段（如囊膜糖蛋白gp5的orf5），无法提供猪繁殖与呼吸综合征病毒的全基因组信息。一代测序采用边合成边测序的方法，通过在dna复制过程中捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记（通常为荧光分子标记）来确定dna序列，以其高准确性和长读长优势适用于小片段序列分析，其与荧光定量pcr结合可实现prrsv的定性和分型。随着基因组学研究的不断深入，对测序通量和速度的需求日益增加，荧光定量pcr和一代测序技术逐渐难以满足大规模基因组测序的需求，于是高通量测序技术应运而生。高通量测序以高通量、低成本、速度快的特点，迅速成为基因组学研究的主流技术。因此，提供一种适用于通过高通量测序技术进行猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组测序的引物组对于猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速诊断和分型及全基因组研究具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供基于全基因组检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv-2）的引物组、建库方法及应用；本专利技术的引物组具备良好的特异性、灵敏性，在猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组扩增、制备扩增所需要的试剂或试剂盒中具有良好的应用前景。本专利技术的建库方法适配于二代测序平台和纳米孔测序平台，自动化程度高，即使在病毒含量低至1copies/μl的样品中，也能获得95%以上的猪繁殖与呼吸综合征病毒序列，测序深度可达1000x以上；且在二代测序平台测序时，每份样品序列数仅需5mb；在纳米孔测序平台测序时，每份样品数据量仅需100mb。
2、本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：
3、第一方面，本专利技术提供了一种基于全基因组检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物组，所述引物组包括16对引物，16对引物的上游引物和下游引物的序列如seq id no .1～seq id no .32所示。
4、在本专利技术的一些实施方式中，序列如seq id no .1～seq id no .32所示的16对引物间隔地分为引物组1和引物组2，如表4所示。
5、第二方面，本专利技术提供了一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组扩增的试剂，所述试剂包括第一方面所述的引物组。
6、在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂包括两组试剂，其中一组试剂包括第一方面所述的引物组1，另一组试剂包括第一方面所述的引物组2。
7、第三方面，本专利技术提供了一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组扩增的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的引物组或第二方面所述的试剂。
8、第四方面，本专利技术提供了第一方面所述的引物组或第二方面所述的试剂或第三方面所述的试剂盒在猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组扩增中的应用。
9、第五方面，本专利技术提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组建库方法，所述方法包括使用第一方面所述的引物组或第二方面所述的试剂或第三方面所述的试剂盒进行多重pcr扩增。
10、在本专利技术的一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：
11、（1）采集样本并对样本进行核酸提取；
12、（2）对步骤（1）提取得到的核酸进行反转录得到cnda；
13、（3）使用第一方面所述的引物组或第二方面所述的试剂或第三方面所述的试剂盒对步骤（2）反转录得到的cnda进行多重pcr扩增；
14、（4）构建测序文库；
15、（5）上机测序；
16、（6）生物信息学分析。
17、在本专利技术的一些实施方式中，所述步骤（1）的样本包括粪便、肠道组织、血液等中一种以上。
18、在本专利技术的一些实施方式中，所述步骤（1）核酸提取的方法包括磁珠法。
19、在本专利技术的一些实施方式中，所述步骤（3）扩增得到的扩增产物长度在1000～1400bp之间，优选为1200bp。
20、在本专利技术的一些实施方式中，所述步骤（3）扩增的程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，60℃变性30s，72℃变性90s，共进行30个循环；72℃延伸5min。
21、在本专利技术的一些实施方式中，所述步骤（3）扩增的反应试剂包括vahts pathogendna multiplex pcr mix、cdna、ddh2o以及第一方面所述的引物组。
22、在本专利技术的一些实施方式中，所述步骤（3）的扩增分两组进行，即分别使用第一方面所述的引物组1和第一方面所述的引物组2对步骤（2）反转录得到的cnda进行多重pcr扩增，然后合并扩增产物。
23、在本专利技术的一些实施方式中，所述步骤（3）扩增的一个反应试剂中每25μl反应试剂包括vahts pathogen dna multiplex pcr mix 12.5μl、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于全基因组检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括所述引物组包括16对引物，16对引物的上游引物和下游引物的序列如SEQ ID NO .1～SEQ ID NO .32所示。
2.一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组扩增的试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求1所述的引物组。
3.一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组扩增的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂。
4.权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂或权利要求3所述的试剂盒在猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组扩增中的应用。
5.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组建库方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂或权利要求3所述的试剂盒进行多重PCR扩增。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）的样本包括粪便、肠道组织、血液中一种以上；
8.根据权利要求7
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，当所述步骤（4）构建测序文库在二代测序平台上进行时，构建测序文库的步骤还包括对接头连接步骤得到的产物进行纯化和/或对酶切消化步骤得到的产物进行纯化；
10.根据权利要求7～9中任一项所述的方法，其特征在于，所述纯化包括使用纯化磁珠进行纯化。
...【技术特征摘要】
1.一种基于全基因组检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括所述引物组包括16对引物，16对引物的上游引物和下游引物的序列如seq id no .1～seq id no .32所示。
2.一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组扩增的试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求1所述的引物组。
3.一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组扩增的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂。
4.权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂或权利要求3所述的试剂盒在猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组扩增中的应用。
5.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组建库方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂或权利要求3所述的试...
【专利技术属性】
技术研发人员：原霖，孙德虎，张淼洁，孙新然，牛婷婷，贾骁晔，崔灿，唐欣愉，王馨迪，徐阳，
申请(专利权)人：北京中科基因技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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