【技术实现步骤摘要】
本申请涉及蛋白质工程领域，具体涉及一种hiv-1crf 55_01b gp140三聚体的制备方法。
技术介绍
1、hiv进入靶细胞由包膜糖蛋白(env)发挥作用，env是由gp120和gp41通过非共价结合成的稳定的三聚体，介导病毒核酸进入宿主细胞，是hiv治疗策略的一个重要靶点。gp120上的cd4结合位点是在糖蛋白内结构域和外结构域的界面处形成的保守空腔。在gp120与cd4结合后，会发生一系列构象变化，导致共受体结合位点(ccr5和cxcr4趋化因子受体)的产生和暴露。hiv进入细胞的多步骤过程为防止病毒进入提供了一系列独特的靶点，针对这些靶点的药物被称为hiv进入抑制剂。在免疫及结构研究中，为了获得可溶性的env三聚体，常从gp41中删除跨膜(tm)区域和细胞质尾部(ct)，创建包含gp120和gp41外结构域(gp41ecto)的gp140蛋白。可溶性gp140与在完整的hiv-1病毒粒子中观察到的gp120分子排列几乎相同。同时，gp140在表达过程中自动组装成三聚体。
2、重组型hiv-1crf 55_01b gp140(包膜糖蛋白胞外结构域)三聚体是一种高度糖基化的分泌型蛋白，与宿主细胞膜上的cd4受体和共受体(ccr5和cxcr4趋化因子受体)有高度亲和力。hiv-1crf 55_01b gp140由644个氨基酸组成，分子量为140-150kd。目前，hivgp140在研究抗原与抗体或药物小分子相互作用、结构生物学等领域有广泛应用。因此，探究hiv-1crf 55_01b gp140的重组表达方法
3、有鉴于此，特提出本申请。
技术实现思路
1、基于此，本申请一个或者多个实施例提供一种hiv-1crf 55_01b gp140三聚体的制备方法。包括如下技术方案：
2、本申请的一个或者多个实施例提供一种hiv-1crf 55_01b gp140三聚体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
3、培养融合蛋白的重组表达细胞，收集上清；所述融合蛋白包括seq id no.1所示的hiv-1crf 5501_b gp140以及纯化标签；
4、将所述上清上样至纯化标签亲和层析柱，平衡，洗脱，收集洗脱液；
5、对所述洗脱液进行透析，超滤，收集浓缩液；以及，
6、采用体积排除色谱法对所述浓缩液纯化，制备hiv-1crf 55_01b gp140三聚体。
7、在本申请的一些实施方式中，平衡采用的平衡缓冲液包括水以及45mm-55mm tris和100mm-200mm nacl，ph值为8.5-8.8；
8、可选地，所述平衡缓冲液的流速为0.5ml/min-1.5ml/min。
9、在本申请的一些实施方式中，所述纯化标签包括flag标签。
10、在本申请的一些实施方式中，洗脱采用的洗脱缓冲液包括水以及100μg/ml-200μg/ml 3×flag，45mm-55mm tris，100mm-200mm nacl，ph值为8.5-8.8；
11、可选地，所述洗脱缓冲液的流速为0.5ml/min-1.5ml/min。
12、在本申请的一些实施方式中，透析采用的透析袋的截留分子量超过30kda。
13、在本申请的一些实施方式中，透析采用的透析缓冲液包括水以及45mm-55mm tris和100mm-200mm nacl，ph值为8.5-8.8。
14、在本申请的一些实施方式中，超滤采用的超滤管的截留分子量超过30kda。
15、在本申请的一些实施方式中，所述重组表达细胞包括hek293f细胞。
16、在本申请的一些实施方式中，收集所述上清的方式包括膜滤；
17、可选地，膜滤采用的滤膜孔径为40μm-50μm。
18、在本申请的一些实施方式中，所述体积排除色谱法采用cloumn superose6increase 10/300gl。
19、本申请的一个或多个实施例细节在下面的描述中提出，本申请的其他特征、目的和优点将从说明书及其权利要求书变得明显。
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1.HIV-1CRF 55_01B gp140三聚体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的HIV-1CRF 55_01B gp140三聚体的制备方法，其特征在于，平衡采用的平衡缓冲液包括水以及45mM-55mM Tris和100mM-200mM NaCl，pH值为8.5-8.8；
3.根据权利要求1所述的HIV-1CRF 55_01B gp140三聚体的制备方法，其特征在于，所述纯化标签包括Flag标签。
4.根据权利要求3所述的HIV-1CRF 55_01B gp140三聚体的制备方法，其特征在于，洗脱采用的洗脱缓冲液包括水以及100μg/mL-200μg/mL 3×Flag，45mM-55mM Tris，100mM-200mM NaCl，pH值为8.5-8.8；
5.根据权利要求1所述的HIV-1CRF 55_01B gp140三聚体的制备方法，其特征在于，透析采用的透析袋的截留分子量超过30kDa。
6.根据权利要求1所述的HIV-1CRF 55_01B gp140三聚体的制备
7.根据权利要求1所述的HIV-1CRF 55_01B gp140三聚体的制备方法，其特征在于，超滤采用的超滤管的截留分子量超过30kDa。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的HIV-1CRF 55_01B gp140三聚体的制备方法，其特征在于，所述重组表达细胞包括HEK293F细胞。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的HIV-1CRF 55_01B gp140三聚体的制备方法，其特征在于，收集所述上清的方式包括膜滤；
10.根据权利要求1至7中任一项所述的HIV-1CRF 55_01B gp140三聚体的制备方法，其特征在于，所述体积排除色谱法采用Cloumn Superose 6Increase 10/300GL。
...【技术特征摘要】
1.hiv-1crf 55_01b gp140三聚体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的hiv-1crf 55_01b gp140三聚体的制备方法，其特征在于，平衡采用的平衡缓冲液包括水以及45mm-55mm tris和100mm-200mm nacl，ph值为8.5-8.8；
3.根据权利要求1所述的hiv-1crf 55_01b gp140三聚体的制备方法，其特征在于，所述纯化标签包括flag标签。
4.根据权利要求3所述的hiv-1crf 55_01b gp140三聚体的制备方法，其特征在于，洗脱采用的洗脱缓冲液包括水以及100μg/ml-200μg/ml 3×flag，45mm-55mm tris，100mm-200mm nacl，ph值为8.5-8.8；
5.根据权利要求1所述的hiv-1crf 55_01b gp140三聚体的制备方法，其特征在于，透析采用的透析袋的截留分子量超过30kda。
【专利技术属性】
技术研发人员：魏兰兰，刘田阳，李晓雯，钱纯亘，吴力强，唐姗姗，张思维，
申请(专利权)人：深圳市第三人民医院深圳市肝病研究所，
类型：发明
国别省市：
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