【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种sirt1修饰的工程化间充质干细胞外泌体及其应用。
技术介绍
1、动脉粥样硬化(as)是一种常见的血管疾病，对全球健康构成重大的威胁，会导致多种严重的并发症，如冠心病、心肌梗死、脑卒中和外周动脉疾病。as的一个关键致病机制是内皮-间充质转化(endmt)，其特征是血管内皮细胞(vecs)转分化为间充质表型，这一转变在as进展过程中斑块的发展和解决中起着核心作用，经历了endmt(vecs-endmt)的vecs对血管炎症和斑块形成有重要贡献，而endmt在斑块稳定性和疾病进展中的作用已得到充分证实，突出了其在as中的关键作用，因此，endmt的靶向逆转成为预防和治疗as的一种很有前途的治疗策略。
2、外泌体是一种大小从30到100纳米的纳米级细胞外囊泡，通过多种细胞类型的胞外作用分泌到细胞外环境中，骨髓间充质干细胞(bmscs)的外泌体不仅具有低免疫原性和高耐药性的独特优势，而且还继承了骨髓间充质干细胞的修复和抗炎特性，对as治疗具有重要的潜力，然而，天然骨髓间充质干细胞来源的外泌体对vecs-endmt的调控缺乏足够的靶向能力，很容易被非靶向细胞吸收。此外，天然外泌体不能达到有效的治疗效果，因为它们不能向靶向细胞提供足够的负载内容，为了解决上述挑战，工程化外泌体作为一种天然的纳米级传递平台，为药物传递、治疗干预和生物医学研究提供了新的思路。工程化外泌体已被开发出来，通过基因和化学工程策略在表面表达功能蛋白，从而显著提高了其靶向精度和治疗效果。迄今为止，工程外泌体已被广泛应用于各种疾病
3、为了提高as的防治效果，在工程化外泌体表面过表达的功能蛋白需要刻意选择。沉默信息调节因子2相关酶1(sirt1)是组蛋白去乙酰化酶家族的关键成员，可以考虑，它通过协调信号级联中的蛋白乙酰化/去乙酰化事件来调节一系列病理生理过程，包括dna修复、凋亡和氧化应激。研究表明，sirt1可以通过调节腺苷5‘-单磷酸活化蛋白激酶的表达来减弱内皮细胞中剪切应力介导的endmt。基于这些发现，我们推测，在骨髓间充质干细胞来源的外泌体表面过表达sirt1可以通过工程化方法有效地调节as病变中的vecs-endmt。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种sirt1修饰的工程化间充质干细胞外泌体,该外泌体具有蛋白模块sirt1和靶向模块胆固醇修饰的适配体，可以靶向血管内皮细胞(vecs)，阻滞其转分化为间充质表型，从而达到防治动脉粥样硬化的目的。
2、为实现本专利技术的目的，提供如下的实施方案。
3、在一实施方案中，本专利技术的一种sirt1修饰的工程化间充质干细胞外泌体，包含骨髓间充质干细胞外泌体和在所述外泌体上表达的sirt1蛋白及修饰的适配体(vegf-chol)，所述适配体(vegf)具有seq id no.1所示基因序列，且3'端连接有胆因醇chol，
4、seq id no.1 5'-ccataccggacgcctaaacc gaccgtagaaaaa-3'-chol。
5、上述工程化间充质干细胞外泌体，sirt1蛋白的编码基因具有seq id no.2所示的基因序列。
6、在另一实施方案中，本专利技术还提供一种sirt1修饰的的工程化间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
7、1)将bmscs细胞培养至50％汇合度,置换培养基；
8、2)将重组sirt1基因腺病毒和助感染试剂加入到上步置换后的培养基中培养；
9、3)sirt1基因腺病毒传染进bmscs细胞，换培养基，继续培养；
10、4)当bmscs细胞在含正常血清的培养基中培养至60％-70％汇合度时，换成新鲜的含无外泌体血清的培养基，继续培养，收集细胞上清液，离心去除较大的细胞碎片，再离心将细胞碎片去除干净；
11、5)将去除细胞碎片后的上清液再通过离心去除大囊泡，取上清液采用高速离心沉淀外沁体；
12、6)将上步获得的外泌体进一步纯化，获得纯的外泌体；
13、7)将外泌体采用pbs重悬，加入胆因醇修饰的适配体(vegf-chol)共同孵育，孵育完成后，离心，获得连接有适配体的过表达sirt1的工程化骨髓间充质干细胞外泌体。
14、优选的，上述本专利技术的制备方法，步骤2)中所述sirt1基因(即编码sirt1蛋白的基因)具有seq id no.2所示的序列，
15、atgtttgatattgaatatttcagaaaagatccaagaccattcttcaagtttgcaaaggaaatatatcctg
16、gacaattccagccatctctctgtcacaaattcatagccttgtcagataaggaaggaaaactacttcgcaa
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18、tttgcaacagcatcttgcctgatttgtaaatacaaagttgactgtgaagctgtacgaggagatattttta
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27、gaagaaaaaccacaggaagtacaaacttctaggaatgttgaaagtattgctgaacagatggaaaatccgg
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1.一种SIRT1修饰的工程化间充质干细胞外泌体，包含骨髓间充质干细胞外泌体和在所述外泌体上表达的SIRT1蛋白及修饰的适配体(VEGF-Chol)，所述适配体具有SEQ IDNO.1如下所示基因序列，且3'端连接有胆因醇CHol，SEQ ID NO.1 5'-CCATACCGGACGCCTAAACC GACCGTAGAAAAA-3'-Chol。
2.如权利要求1所述的外泌体，所述SIRT1蛋白的编码基因具有SEQ ID NO.2所示的序列。
3.一种权利要求1或2的工程化间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
4.如权利要求1所述的制备方法，步骤2)中所述助感染试剂为Polybrene。
5.如权利要求1所述的制备方法，步骤3)中所述继续培养，按常规每3天换一次液。
6.如权利要求1所述的制备方法，步骤4)的继续培养为48小时，任选的采用qRT-PCR和western blotting检测感染效率。
7.如权利要求1所述的制备方法，步骤6)中所述进一步纯化，是指将重悬后的外泌体用0.22μm过滤器过滤
8.如权利要求1所述的制备方法，步骤7)中所述共孵育是将250μL外泌体悬液(4×109particles/mL)与250μL适配体(10nM)共同孵育30min。
9.权利要求1或2所述的SIRT1修饰的工程化间充质干细胞外泌体在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种sirt1修饰的工程化间充质干细胞外泌体，包含骨髓间充质干细胞外泌体和在所述外泌体上表达的sirt1蛋白及修饰的适配体(vegf-chol)，所述适配体具有seq idno.1如下所示基因序列，且3'端连接有胆因醇chol，seq id no.1 5'-ccataccggacgcctaaacc gaccgtagaaaaa-3'-chol。
2.如权利要求1所述的外泌体，所述sirt1蛋白的编码基因具有seq id no.2所示的序列。
3.一种权利要求1或2的工程化间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
4.如权利要求1所述的制备方法，步骤2)中所述助感染试剂为polybrene。
5.如权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：皮燕，陈卓，阳莎，白定群，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：
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