【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及癌症分型和基因组学领域，尤其涉及一组用于braf v600e突变型结直肠癌免疫组化分型的基因及其应用。
技术介绍
1、braf v600e突变型结直肠癌(braf v600e crc)是指一类mapk信号通路中egfr和ras下游的丝氨酸/苏氨酸激酶基因突变，导致raf激酶的构象变化，braf激酶和下游mapk通路的激活，进而导致肿瘤细胞增殖和抗凋亡行为增加的结直肠癌。braf v600e突变型结直肠癌发生在约10％的结直肠癌中，这种突变更易发生于高龄、女性、右半肠癌、粘液性和低分化、msi-h型肠癌患者中，好发腹膜和远处淋巴结转移。这一群体预后相对较差，当前对该群体使用的靶向治疗策略所取得的反应仍然有限。
2、高度异质性是恶性肿瘤的主要特征，也是导致抗肿瘤治疗疗效低的主要原因，braf突变型肠癌也不例外。研究者利用转录组测序结合基因表达谱的聚类分析证明brafv600e突变型肠癌存在2种分子亚型，可以分为具有高度炎症反应的bm1型和细胞周期检查点紊乱的bm2型。现有的研究证明bm1和bm2型的braf v600e突变肠癌患者对治疗的反应性和预后差异显著。bm1型肠癌患者对于双靶或者三靶的治疗方案更为敏感，bm1型患者的生存时间几乎是bm2型患者的3倍。同时，bm1型肠癌因为伴随有高度的炎症反应，提示该类型的肠癌患者有望从免疫检查点抑制剂的治疗中获益。
3、尽管基于mrna表达谱测序聚类分析的braf v600e结直肠癌分子分型可以同时揭示braf v600e crc的生物学特征并提示亚型特
技术实现思路
1、本专利技术是要解决现有用于braf v600e结直肠癌分子分型方法存在价格昂贵，流程复杂，临床可及性较差的问题，提供一组用于braf v600e突变型结直肠癌免疫组化分型的基因及其应用。
2、本专利技术提供一组用于braf v600e突变型结直肠癌免疫组化分型的基因，包括如下2个基因：cd8基因和tem4基因。
3、上述用于braf v600e突变型结直肠癌免疫组化分型的基因的筛选方法，包括以下步骤：
4、步骤一：从braf v600e突变型结直肠癌亚型的差异表达基因中筛选出与分型表型显著相关的基因，并基于分型信息分别构建分类模型。利用随机森林算法、lasso回归和svm-rfe三种机器学习算法进行特征选择，最终取三种算法筛选结果的交集，获得在分型中具有显著区分能力的关键基因；
5、步骤二：基于braf v600e突变型结直肠癌的mrna表达谱测序数据，通过roc分析，确定包含cd8基因在内的15个候选基因；
6、步骤三：取braf v600e突变型结直肠癌患者的石蜡包埋组织，进行免疫组化检测，对15个候选基因进行免疫组化评分；
7、步骤四：确定免疫组化评分的cut-off值；
8、步骤五：基于步骤三的免疫组化评分结果，依据步骤四确定的cut-off值，将候选基因按表达水平划分为高表达和低表达两组，随后，采用r语言的决策树算法筛选出对bm分型具有最佳区分能力的基因组合，cd8基因和tem4基因组合。
9、进一步的，步骤一中利用三种机器学习算法进行筛选的具体方法为：通过三种机器学习算法独立计算基因的重要性值，依据重要性值对基因在分型中的区分能力进行排序，筛选出重要性较高的特征基因。
10、进一步的，步骤二中所述roc分析利用关键基因的mrna表达值区分各亚型的准确度，以曲线下面积auc作为准确度的量化标准，根据auc值进行候选基因的排序，排除无法提供免疫组化抗体的基因，筛选出包含cd8基因在内的15个候选基因。
11、进一步的，步骤三中免疫组化评分标准为：
12、①肿瘤细胞核着色的标志物评分标准：
13、阳性肿瘤细胞占全体肿瘤细胞的百分比；
14、②肿瘤细胞胞质着色的标志物评分标准：
15、3+：>80％的浸润癌细胞呈现强、完整、均匀的细胞质染色，
16、2+：>80％的浸润癌细胞呈现中等强度、完整的细胞质染色，
17、1+：>80％的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞质染色，
18、-：无染色或≤80％的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞质染色；
19、③cd8免疫细胞标志物评分标准：
20、阳性细胞数/肿瘤核心(ct)和肿瘤浸润交界(im)面积。
21、进一步的，步骤四中确定免疫组化评分的cut-off值的具体方法为：
22、将免疫组化评分作为自变量，患者的bm分型作为因变量，利用逻辑回归模型建立预测关系，通过遗传算法在自变量的值域范围内搜索截断点，计算各候选点的敏感度和特异度，并以敏感度+特异度的最大值为准则，确定各抗体的免疫组化评分cut-off值。
23、进一步的，步骤五中采用r语言的决策树算法进行建模分析，以bm分型为因变量，候选基因为自变量，构建分类决策树模型。通过计算候选基因的重要性分数，筛选出对bm分型具有最佳区分能力的基因组合。
24、本专利技术braf v600e突变型结直肠癌免疫组化分型的方法为：
25、免疫组化bm1型：cd8阳性，tem4阴性；
26、免疫组化bm2型：①cd8阴性，任意tem4表达；或②cd8阳性，tem4阳性。
27、其中cd8阳性定义为cd8阳性细胞数/肿瘤核心(ct)和肿瘤浸润交界(im)面积≥350/mm2。tem4阳性定义为>80％的浸润癌细胞呈现强、完整、均匀的细胞质染色，或者>80％的浸润癌细胞呈现中等强度、完整的细胞质染色。cd8阴性定义为cd8阳性细胞数/肿瘤核心(ct)和肿瘤浸润交界(im)面积＜350/mm2。tem4阴性定义为>80％的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞质染色，或者无染色或≤80％的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞质染色。
28、本专利技术提供上述一组用于braf v600e突变型结直肠癌免疫组化分型的基因在制备braf v600e突变型结直肠癌分型检测试剂盒中应用。
29、本专利技术提供一种braf v600e突变型结直肠癌分型检测试剂盒，该试剂盒包含如下生物标志物，所述生物标志物为所述的一组用于braf v600e突变型结直肠癌免疫组化分型的基因。
30、本专利技术的有益效果：
31、目前针对braf v600e突变型结直肠癌，尚无公认的免疫组化分型方法。本专利技术基于crc brafv600e多组学数据集，确定了cd8和tem4作为该癌种本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一组用于BRAF V600E突变型结直肠癌免疫组化分型的基因，其特征在于，所述免疫组化分型的基因包括如下2个基因：CD8基因和TEM4基因。
2.如权利要求1所述的用于BRAF V600E突变型结直肠癌免疫组化分型的基因，其特征在于，所述免疫组化分型的基因的筛选方法，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的免疫组化分型的基因的筛选方法，其特征在于，步骤一中利用三种机器学习算法进行筛选的具体方法为：通过三种机器学习算法独立计算基因的重要性值，依据重要性值对基因在分型中的区分能力进行排序，筛选出重要性较高的特征基因。
4.根据权利要求2所述的免疫组化分型的基因的筛选方法，其特征在于，步骤二中所述ROC分析利用关键基因的mRNA表达值区分各亚型的准确度，以曲线下面积AUC作为准确度的量化标准，根据AUC值进行候选基因的排序，排除无法提供免疫组化抗体的基因，筛选出包含CD8基因在内的15个候选基因。
5.根据权利要求2所述的免疫组化分型的基因的筛选方法，其特征在于，步骤三中免疫组化评分标准为：
6.根据权利要求2所述的免疫组
7.根据权利要求2所述的免疫组化分型的基因的筛选方法，其特征在于，步骤五中采用R语言的决策树算法进行建模分析，以BM分型为因变量，候选基因为自变量，构建分类决策树模型。通过计算候选基因的重要性分数，筛选出对BM分型具有最佳区分能力的基因组合。
8.BRAF V600E突变型结直肠癌免疫组化分型的方法，其特征在于，该方法为：
9.如权利要求1所述的一组用于BRAF V600E突变型结直肠癌免疫组化分型的基因在制备BRAF V600E突变型结直肠癌分型检测试剂盒中应用。
10.一种BRAF V600E突变型结直肠癌分型检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含如下生物标志物，所述生物标志物为如权利要求1所述的一组用于BRAF V600E突变型结直肠癌免疫组化分型的基因。
...【技术特征摘要】
1.一组用于braf v600e突变型结直肠癌免疫组化分型的基因，其特征在于，所述免疫组化分型的基因包括如下2个基因：cd8基因和tem4基因。
2.如权利要求1所述的用于braf v600e突变型结直肠癌免疫组化分型的基因，其特征在于，所述免疫组化分型的基因的筛选方法，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的免疫组化分型的基因的筛选方法，其特征在于，步骤一中利用三种机器学习算法进行筛选的具体方法为：通过三种机器学习算法独立计算基因的重要性值，依据重要性值对基因在分型中的区分能力进行排序，筛选出重要性较高的特征基因。
4.根据权利要求2所述的免疫组化分型的基因的筛选方法，其特征在于，步骤二中所述roc分析利用关键基因的mrna表达值区分各亚型的准确度，以曲线下面积auc作为准确度的量化标准，根据auc值进行候选基因的排序，排除无法提供免疫组化抗体的基因，筛选出包含cd8基因在内的15个候选基因。
5.根据权利要求2所述的免疫组化分型的基因的筛...
【专利技术属性】
技术研发人员：张艳桥，刘超，孟宏学，阮玉莉，吴桐，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：
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