【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程，具体涉及一种n-加氧酶双位点突变体及其在合成氮霉素中的应用。
技术介绍
1、氮霉素，即2-硝基咪唑，是一种硝基咪唑类有机化合物，是第一个发现的硝基咪唑类抗生素，在医药领域具有广泛应用，已被证明对阴道毛滴虫等具有良好抗性，可用于肿瘤治疗中的放射增敏剂，同时能够用于合成一些多硝基咪唑类炸药。目前，氮霉素的制备主要是利用传统化学合成法，该过程以s-甲基异硫脲硫酸盐或o-甲基异脲硫酸盐与氨基乙醛缩二甲醇为初始原料合成2-氨基咪唑硫酸盐，然后在酸性条件下使用硫酸铜作为催化剂合成终产物氮霉素。但是这种合成法工艺复杂，使用大量有机试剂，包括乙酸乙酯、乙醇等，并且产生大量hcl、hbf4废酸和金属废水，给操作和使用带来危险性；同时这种合成法产率较低，仅有30％左右。
2、在绿色化学的要求下，迫切需要一种新的方法合成氮酶素，近年来，生物催化(酶催化)作为一种可持续的技术得到了普及，生物合成方法绿色环保，反应条件温和，不使用浓酸、有机溶剂、金属催化剂，产物特异性好，副产物少。研究证明来自streptomycescattleya dsmz 46488中的n-加氧酶(rohs)能够催化2-氨基咪唑氧化为氮霉素，但其催化效率极低(记载在hedges,jason b,ryan,katherine s.in vitro reconstitution of thebiosynthetic pathway to the nitroimidazole antibiotic azomycin.[j].angewandtechemie
技术实现思路
1、为解决现有技术中n-加氧酶在催化2-氨基咪唑合成氮霉素过程中，其催化合成氮霉素的产量及产率较低的问题，本专利技术提供了一种n-加氧酶双位点突变体及其在合成氮霉素中的应用。
2、本专利技术的具体技术方案如下：
3、本专利技术的目的之一在于提供一种n-加氧酶双位点突变体，所述的突变体氨基酸序列如seq id no.1所示。
4、本专利技术的目的之二在于提供一种n-加氧酶双位点突变体，所述的突变体编码序列如seq id no.2所示。
5、本专利技术的目的之三在于提供含有上述编码序列的表达载体。
6、进一步限定，所述构建表达载体的出发质粒为petduet-1。
7、本专利技术的目的之四在于提供含有上述表达载体的重组菌。
8、进一步限定，所述构建重组菌的宿主菌为大肠杆菌。
9、本专利技术的目的之五在于提供上述n-加氧酶双位点突变体、编码序列、表达载体或重组菌在合成氮酶素中的应用。
10、本专利技术的目的之六在于提供一种合成氮酶素的方法，所述方法是在含有feso4·7h2o、吩嗪甲硫酸盐、nadh和hepes缓冲溶液的反应体系中，加入2-氨基咪唑和上述含有n-加氧酶双位点突变体的重组菌合成氮霉素。
11、进一步限定，所述的重组菌浓度为10-100od600。
12、进一步限定，所述的2-氨基咪唑浓度为2-20mm。
13、进一步限定，所述的feso4·7h2o浓度为1-10mm。
14、进一步限定，所述的吩嗪甲硫酸盐浓度为50μm。
15、进一步限定，所述的nadh缓冲溶液浓度为5-50mm。
16、进一步限定，所述的hepes缓冲溶液浓度为20mm。
17、更进一步限定，所述的2-氨基咪唑、feso4·7h2o、吩嗪甲硫酸盐、nadh和hepes缓冲溶液的质量百分比为1：0.5-5：2.5-25：2.5-25：1-10。
18、进一步限定，所述的反应体系中反应温度为20-40℃。
19、进一步限定，所述的反应体系中反应时间为10-72h。
20、进一步限定，所述的反应体系中反应ph为4.5-7.5。
21、本专利技术的有益效果：
22、(1)本专利技术提供的n-加氧酶双位点突变体相比于野生型n-加氧酶，其与底物之间具有更大的相互作用力，提高了其结合自由能以及与底物的亲和力，证明其具有较高的催化活性，本专利技术提供的n-加氧酶双位点突变体合成的氮霉素产量为1.68mm，相比于野生型n-加氧酶提高了2.8倍；其产率能够达到42％，相比于野生型n-加氧酶提高了2.3倍。
23、(2)相对于传统化学法，该方法绿色环保，对环境污染小，合成工艺简但，反应条件温和，安全性较高。
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1.一种N-加氧酶双位点突变体，其特征在于，所述的突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种N-加氧酶双位点突变体，其特征在于，所述的突变体编码序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2所述的编码序列。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，构建所述表达载体的出发质粒为pETDuet-1。
5.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌含有权利要求3所述的表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，构建所述重组菌的宿主菌为大肠杆菌。
7.权利要求1或2所述的N-加氧酶双位点突变体、权利要求3所述的表达载体或权利要求5所述的重组菌在合成氮酶素中的应用。
8.一种合成氮酶素的方法，其特征在于，所述方法是在含有FeSO4·7H2O、吩嗪甲硫酸盐、NADH和HEPES缓冲溶液的反应体系中，加入2-氨基咪唑和权利要求5所述的重组菌合成氮霉素。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述重组菌浓度为10-100OD60
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的反应体系中2-氨基咪唑、FeSO4·7H2O、吩嗪甲硫酸盐、NADH和HEPES缓冲溶液的质量百分比为1：0.5-5：2.5-25：2.5-25：1-10；反应温度为20-40℃，反应时间为10-72h，反应pH为4.5-7.5。
...【技术特征摘要】
1.一种n-加氧酶双位点突变体，其特征在于，所述的突变体氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.一种n-加氧酶双位点突变体，其特征在于，所述的突变体编码序列如seq id no.2所示。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2所述的编码序列。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，构建所述表达载体的出发质粒为petduet-1。
5.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌含有权利要求3所述的表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，构建所述重组菌的宿主菌为大肠杆菌。
7.权利要求1或2所述的n-加氧酶双位点突变体、权利要求3所述的表达载体或权利要求5所述的重组菌在合成氮酶素中的应用。
8.一...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯新军，咸漠，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：
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