【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，具体为一种同时富集无序蛋白及其结合三维基因组结构的方法。
技术介绍
1、无序蛋白（intrinsically disordered proteins，idps），占据人类蛋白质组1/3比例，其特征是生理条件下缺乏稳定的三维结构，在各种生物过程中发挥着重要作用。idps具有通过相分离形成生物分子凝聚体的能力，这一过程促进了三维染色质结构的重组，从而对基因调控、发育和疾病进展产生重大影响。例如，异染色质蛋白1（hp1）介导相分离，导致染色质压缩和异染色质结构域的形成。同样，ctcf增强染色质a-a区室相互作用，维持胚胎干细胞（escs）的自我更新，同时抑制其向神经祖细胞的分化。此外，utx是一种重要的肿瘤抑制因子，具有很强的相分离能力，当其内在无序结构域（intrinsically disorderedregions，idrs）缺失时，utx就会失去凝聚能力，从而导致肿瘤发生。
2、目前，主要有两种策略来研究idps和染色质三维结构之间的关系。casl-drop系统允许在特定基因组位点上通过控制idps诱导液体冷凝物，从而能够观察染色质三维结构变化。另一种方法通过结合1，6-己二醇可以破坏细胞内相分离的特性，通过不同时间处理检测相分离影响染色质三维结构变化。然而，该方法无法理解细胞内原始状态下无序蛋白与染色质三维结构的变化。所以，目前仍然缺乏可以实现无破坏性，全基因组范围内检测无序蛋白和染色质三维结构的方法。
3、生物素化异噁唑（b-isox）是一种能够通过形成微晶富集广谱无序蛋白的
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种同时富集无序蛋白及其结合三维基因组结构的方法，该方法可以同时进行无序蛋白及其介导和/或结合三维结构的富集。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种同时富集无序蛋白及其结合三维基因组结构的方法，包括如下步骤：对待测细胞进行交联、裂解，提取获得细胞核；使用限制性内切酶dpn ii对获得的细胞核进行酶切、末端修复和邻近连接处理；对邻近连接处理后的细胞核进行超声破碎获得超声破碎产物；将所述超声破碎产物一分为二得到产物ⅰ和产物ⅱ，所述产物ⅰ用生物素化异噁唑富集超声破碎后的dna和蛋白的复合体，对所述的dna和蛋白的复合体进行洗涤、洗脱以及蛋白酶处理；蛋白酶处理后提取、纯化dna，对纯化后的dna进行建库测序；所述产物ⅱ经核酸酶处理、提取蛋白，然后进行蛋白质谱分析。
4、优选地，使用甲醛和二琥珀酰亚胺戊二酸对待测细胞进行交联。
5、更优选地，所述交联包括如下步骤：将待测细胞重悬于1×pbs溶液中，加入甲醛孵育8~15min后加甘氨酸终止反应；终止反应后用1×pbs溶液洗涤，使用含有3mm二琥珀酰亚胺戊二酸的1×pbs溶液重新悬浮，室温下孵育30~50min后，加入甘氨酸继续孵育；使用含有0.05%牛血清白蛋白的1×pbs溶液洗涤，调整细胞浓度后离心、去上清，收集细胞于液氮中冷冻保存。
6、优选地，所述裂解包括如下步骤：将交联后的细胞重悬于1×裂解缓冲液中，并加入蛋白酶抑制剂，在冰上孵育10~20min后离心，弃上清获得沉淀1；使用1×neb缓冲液3.1洗涤沉淀1，离心、弃上清获得沉淀2；使用1×neb缓冲液3.1重悬沉淀2，加入1%sds孵育8~12min，用10% triton x-100终止反应。
7、优选地，所述末端修复的反应液包括5~10μl 10×neb缓冲液3.1，1~2μl10mmdctp，1~2μl10mm dgtp，1~2μl10mm dttp，10~20μl 1mm生物素-14-datp和8~15μl 5u/μldna聚合酶i大片段klenow。
8、优选地，所述邻近连接的反应液包括100~150μl 10×t4连接缓冲液，100~150μl10% triton x-100，40~60μl t4 dna连接酶和300~400μl milli-q水。
9、优选地，所述超声破碎的反应液包括含有8~15μl蛋白酶抑制剂的超声缓冲液；所述超声缓冲液包括40~60mm hepes，120~160mm nacl，0.5~2mm edta，0.5~2% triton x-100和0.05~0.2% sds。
10、优选地，所述生物素化异噁唑富集的方式包括如下步骤：超声破碎处理后加入80~120μm生物素化异噁唑，于4℃下旋转孵育0.5~2h。
11、优选地，所述洗涤的缓冲液包括1×蛋白酶抑制剂，0.05~0.2mm pmsf，10~30mm β-巯基乙醇，10~30mm tris-hcl，120~180mm nacl，3~8mm mgcl2，0.1~0.8% np-40和5~15%甘油。
12、优选地，所述洗脱的缓冲液包括5~15mm tris-hcl，0.05~0.2% sds，120~180mmnacl和3~8mm dtt。
13、本专利技术与现有技术相比，具有以下有益效果：
14、本专利技术公开了一种同时富集无序蛋白及其结合三维基因组结构的方法（disp-hic，disordered protein——high-throughput chromosome conformation capture），本专利技术使用甲醛和二琥珀酰亚胺戊二酸（dsg）交联细胞，固定染色质三维结构特征；并进一步优化连接体系和酶切体系，提高连接效率；将连接后的产物经超声破碎后收集超声破碎产物，将该产物一分为二，一部分产物使用生物素化异噁唑捕获dna和蛋白复合体，使用蛋白酶消化蛋白质，最后对dna进行建库测序；另外一部分产物经核酸酶处理、提取蛋白，进行蛋白质谱分析。本专利技术可以同时进行无序蛋白及其介导和/或结合三维结构的富集，实现全基因组无破坏性检测无序蛋白结合的染色质三维结构，为在全基因组范围内研究无序蛋白介导的染色质三维结构特征提供了有效途径。
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1.一种同时富集无序蛋白及其结合三维基因组结构的方法，其特征在于，包括如下步骤：对待测细胞进行交联、裂解，提取获得细胞核；使用限制性内切酶Dpn II对获得的细胞核进行酶切、末端修复和邻近连接处理；对邻近连接处理后的细胞核进行超声破碎获得超声破碎产物；将所述超声破碎产物一分为二得到产物Ⅰ和产物Ⅱ，所述产物Ⅰ用生物素化异噁唑富集超声破碎后的DNA和蛋白的复合体，对所述的DNA和蛋白的复合体进行洗涤、洗脱以及蛋白酶处理；蛋白酶处理后提取、纯化DNA，对纯化后的DNA进行建库测序；所述产物Ⅱ经核酸酶处理、提取蛋白，然后进行蛋白质谱分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用甲醛和二琥珀酰亚胺戊二酸对待测细胞进行交联。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述交联包括如下步骤：将待测细胞重悬于1×PBS溶液中，加入甲醛孵育8~15min后加甘氨酸终止反应；终止反应后用1×PBS溶液洗涤，使用含有3mM二琥珀酰亚胺戊二酸的1×PBS溶液重新悬浮，室温下孵育30~50min后，加入甘氨酸继续孵育；使用含有0.05%牛血清白蛋白的1×PBS溶液洗涤，
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解包括如下步骤：将交联后的细胞重悬于1×裂解缓冲液中，并加入蛋白酶抑制剂，在冰上孵育10~20min后离心，弃上清获得沉淀1；使用1×NEB缓冲液3.1洗涤沉淀1，离心、弃上清获得沉淀2；使用1×NEB缓冲液3.1重悬沉淀2，加入1%SDS孵育8~12min，用10% Triton X-100终止反应。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述末端修复的反应液包括5~10μL 10×NEB缓冲液3.1，1~2μL10mM dCTP，1~2μL10mM dGTP，1~2μL10mM dTTP，10~20μL 1mM生物素-14-dATP和8~15μL 5U/μL DNA聚合酶I大片段Klenow。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述邻近连接的反应液包括100~150μL 10×T4连接缓冲液，100~150μL 10% Triton X-100，40~60μL T4 DNA连接酶和300~400μLMilli-Q水。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声破碎的反应液包括含有8~15μL蛋白酶抑制剂的超声缓冲液；所述超声缓冲液包括40~60mM HEPES，120~160mM NaCl，0.5~2mMEDTA，0.5~2% Triton X-100和0.05~0.2% SDS。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物素化异噁唑富集的方式包括如下步骤：超声破碎处理后加入80~120μM生物素化异噁唑，于4℃下旋转孵育0.5~2h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤的缓冲液包括1×蛋白酶抑制剂，0.05~0.2mM PMSF，10~30mM β-巯基乙醇，10~30mM Tris-HCl，120~180mM NaCl，3~8mMMgCl2，0.1~0.8% NP-40和5~15%甘油。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱的缓冲液包括5~15mM Tris-HCl，0.05~0.2% SDS，120~180mM NaCl和3~8mM DTT。
...【技术特征摘要】
1.一种同时富集无序蛋白及其结合三维基因组结构的方法，其特征在于，包括如下步骤：对待测细胞进行交联、裂解，提取获得细胞核；使用限制性内切酶dpn ii对获得的细胞核进行酶切、末端修复和邻近连接处理；对邻近连接处理后的细胞核进行超声破碎获得超声破碎产物；将所述超声破碎产物一分为二得到产物ⅰ和产物ⅱ，所述产物ⅰ用生物素化异噁唑富集超声破碎后的dna和蛋白的复合体，对所述的dna和蛋白的复合体进行洗涤、洗脱以及蛋白酶处理；蛋白酶处理后提取、纯化dna，对纯化后的dna进行建库测序；所述产物ⅱ经核酸酶处理、提取蛋白，然后进行蛋白质谱分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用甲醛和二琥珀酰亚胺戊二酸对待测细胞进行交联。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述交联包括如下步骤：将待测细胞重悬于1×pbs溶液中，加入甲醛孵育8~15min后加甘氨酸终止反应；终止反应后用1×pbs溶液洗涤，使用含有3mm二琥珀酰亚胺戊二酸的1×pbs溶液重新悬浮，室温下孵育30~50min后，加入甘氨酸继续孵育；使用含有0.05%牛血清白蛋白的1×pbs溶液洗涤，调整细胞浓度后离心、去上清，收集细胞于液氮中冷冻保存。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解包括如下步骤：将交联后的细胞重悬于1×裂解缓冲液中，并加入蛋白酶抑制剂，在冰上孵育10~20min后离心，弃上清获得沉淀1；使用1×neb缓冲液3.1洗涤沉淀1，离心、弃上清获得沉淀2；使用1×neb缓冲液3.1重悬沉淀2，加入1%sds孵育8~12min，用10% triton x-100终止反应。
5.根据权利要求1所述的方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵志虎，侯甲宝，谢德健，沈文龙，张彦，李平，邓峻玮，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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