【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶催化反应领域，具体是一种基于溶胶－凝胶法，在无助溶剂体系下一锅法制备固定化酶的方法。
技术介绍
1、酶具有高催化活性和底物特异性，酶催化反应符合绿色化学原理，具有环境友好性和高选择性的优点，在制药、精细化工、食品等方面得到了广泛的应用。固定化酶技术可以有效提升酶的稳定性并降低酶的回收难度，进一步提升酶在工业应用中的经济价值。固定化的方法通常包括吸附、共价结合、交联、包埋的方式。溶胶－凝胶法固定化酶作为一种经典的包埋法固定化酶技术，在制备固定化酶颗粒、粉末以及涂层等方面有着广泛的应用潜力。
2、大多数溶胶－凝胶法固定化酶的过程都不可避免地使用醇或者酸以促进硅烷前体的水解。ganonyan等(entrapment ofenzymes in silicaaerogels[j].materialstoday,2020,33:24-35.)以氯化氢为助溶剂促进硅烷前驱体的水解，利用溶胶－凝胶法固定三种不同的酶，实现在二氧化硅气凝胶中包埋酶，但体系中过量的酸会影响固定化酶的活性。mangiagalli等(diverse effects ofaqueous polar co-solvents oncandidaantarctica lipase b[j].international journal of biologicalmacromolecules,2020,150:930-940.)研究了三种共溶剂(甲醇、丙酮和二甲基亚砜)对溶胶－凝胶法固定南极假丝酵母脂肪酶b(calb)过程中结构和功能的影响，研究发现溶剂
3、因此，保持溶胶－凝胶法固定化酶较高的储存稳定性与热稳定性，提高固定化酶活性位点的可及性，对溶胶－凝胶法固定化酶的生产与应用具有重要的意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的为针对当前技术中存在的不足，提供一种在无助溶剂体系下一锅法溶胶－凝胶固定化酶的制备方法。该方法避免使用助溶剂，通过简单的加热和搅拌完成硅烷前驱体的水解。同时用正己烷对老化的凝胶进行清洗，去除硅烷前驱体水解形成的甲醇及残余的水，避免极性溶剂与酶的长期接触，并降低体系中液体的表面张力，防止硅网络的过度收缩，最后干燥得到溶胶－凝胶固定化酶。本专利技术流程简单，操作简便。在制备过程中无助溶剂的使用，降低了酶活性损失的风险。并通过避免硅骨架的过度收缩提高了固定化酶活性位点的可及性，进一步提升了固定化酶的活性。
2、本专利技术技术方案如下：
3、一种在无助溶剂体系下一锅法制备溶胶凝胶固定化酶的方法，该方法包括如下步骤:
4、(1)将正硅酸甲酯，甲基三甲氧基硅烷和去离子水在25～70℃水浴中混合15～90分钟得到均相溶液；
5、其中，正硅酸甲酯、甲基三甲氧基硅烷、去离子水的质量比为1:3.65～3.75:3.10～3.15；
6、(2)将步骤(1)得到的均相溶液放置冰浴中，并加入粗酶液和聚乙二醇在冰浴下继续混合搅拌15～20分钟，得到溶胶溶液；
7、其中，粗酶液、聚乙二醇的质量比为1:0.045～0.075；均相溶液、粗酶液、聚乙二醇的质量比为1:0.4～0.6:0.025～0.035；
8、(3)将步骤(2)得到的溶胶溶液中加入氟化钠水溶液，在冰浴下继续混合搅拌5～10分钟，形成凝胶网络；
9、其中，溶胶溶液、氟化钠水溶液的质量比为1:0.080～0.086；
10、步骤(2)所述的粗酶液中的酶为南极假丝酵母脂肪酶b(calb)；
11、步骤(2)所述的粗酶液中calb的蛋白浓度为2～10wt％；
12、步骤(2)所述的聚乙二醇为聚乙二醇200、聚乙二醇400或聚乙二醇600；
13、步骤(3)所述的氟化钠的浓度为0.05～5mol/l；
14、(4)凝胶老化后，将其粉碎并用正己烷洗涤，以去除残余的水和硅烷水解产生的甲醇；
15、其中，每次洗涤正己烷的用量为3～8ml/g；
16、(5)将凝胶在25～70℃下干燥24～48小时，得到溶胶－凝胶固定化酶；
17、所述方法得到的溶胶－凝胶固定化酶的应用，用于酶催化反应精馏，使用固定化酶与反应精馏的耦合以同步反应和分离过程。
18、本专利技术的实质性特点为：
19、当前技术中，大多数溶胶－凝胶制备固定化酶的过程中都不可避免地使用醇或者酸以促进硅烷前驱体的水解，进而得到溶胶－凝胶固定化酶。
20、本专利技术在固定化酶合成过程中不加入助溶剂，减小了由于高浓度醇类物质的存在对酶活性产生的风险。这是利用硅烷前驱体和水在相界面处就可以发生有效的水解，并且硅烷前驱体水解的产物甲醇也可以作为体系的助溶剂；并且采用正己烷清洗老化的凝胶以除去因硅烷前体水解产生的甲醇及残余的水，缩短了calb与醇的接触时间，降低了硅网络结构中液体的毛细力从而避免硅网络的过度收缩对酶造成的挤压，并降低了底物从主体溶液到酶活性位点的传质阻力，从而更好的保护了酶的催化活性。
21、本专利技术的有益效果为：
22、(1)本专利技术在无助溶剂体系下一锅法制备溶胶－凝胶固定化酶，避免使用助溶剂，同时用正己烷对老化的凝胶进行清洗，去除硅烷前驱体水解形成的甲醇及残余的水，降低了硅网络结构中液体的毛细力，避免了由于硅网络结构过度收缩对酶空间结构的挤压，并降低了底物从主体溶液到酶活性位点的传质阻力；
23、(2)本专利技术制备的固定化酶活性相比于传统的固定化酶活性提高了365.83％，为溶胶－凝胶法制备固定化酶的应用提供更高的催化效率；
24、(3)本专利技术所得到的溶胶－凝胶固定化酶具有较高的储存稳定性(见实施例3～8，在40℃条件下储存60天后溶胶－凝胶固定化酶还保持较稳定的活性)。
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1.一种在无助溶剂体系下一锅法制备溶胶凝胶固定化酶的方法，其特征为该方法包括如下步骤:
2.如权利要求1所述的在无助溶剂体系下一锅法制备溶胶凝胶固定化酶的方法，其特征为所述的粗酶液中的酶为南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)。
3.如权利要求1所述的在无助溶剂体系下一锅法制备溶胶凝胶固定化酶的方法，其特征为步骤(2)所述的粗酶液中CALB的蛋白浓度为2～10wt％。
4.如权利要求1所述的在无助溶剂体系下一锅法制备溶胶凝胶固定化酶的方法，其特征为步骤(3)所述的氟化钠的浓度为0.05～5mol/L。
5.如权利要求1所述的在无助溶剂体系下一锅法制备溶胶凝胶固定化酶的方法，其特征为步骤(2)所述聚乙二醇为聚乙二醇200、聚乙二醇400或聚乙二醇600。
6.如权利要求1所述方法得到的溶胶凝胶固定化酶的应用，其特征为用于酶催化反应精馏。
【技术特征摘要】
1.一种在无助溶剂体系下一锅法制备溶胶凝胶固定化酶的方法，其特征为该方法包括如下步骤:
2.如权利要求1所述的在无助溶剂体系下一锅法制备溶胶凝胶固定化酶的方法，其特征为所述的粗酶液中的酶为南极假丝酵母脂肪酶b(calb)。
3.如权利要求1所述的在无助溶剂体系下一锅法制备溶胶凝胶固定化酶的方法，其特征为步骤(2)所述的粗酶液中calb的蛋白浓度为2～10wt％。
【专利技术属性】
技术研发人员：王洪海，贺怡若，喻雄，梁军，郑芊慧，
申请(专利权)人：河北工业大学，
类型：发明
国别省市：
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