【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白质工程和基因工程，具体涉及一种重组纤连蛋白及其制备、纯化方法和应用。
技术介绍
1、纤连蛋白最初是morrison于1948年发现的，由于其遇冷会沉淀的特性，最初被称为冷不溶球蛋白(cold insoluble globulin)，现在一般称为纤维连接蛋白fibronectin，英文缩写为fn。纤连蛋白(fn)是一种分子量约为440kda的大糖蛋白，由2个分子质量为220kda的亚基通过二硫键连接而成的二聚体，整个分子形状是由两条相似的a链及b链组成，呈v形。在人体中纤连蛋白共有20余种，广泛存在于血液、体液及各种组织中，是细胞外基质(ecm)中普遍存在的重要成分，它既是细胞活动过程中的调节因子，也是维持、指导组织结构和ecm组成的重要支架蛋白。
2、天然纤连蛋白和胶原蛋白都可以从动物组织中提取，但产量有限、成本高，制备的产品质量批次间差异大，成分复杂；同时还存在携带病原体的风险，因此限制了纤连蛋白在医学和众多科研领域的广泛应用。dna重组技术能够解决纤连蛋白制备的难题，但是重组纤连蛋白的制备还涉及到较为复杂的纯化问题，目前，与胶原蛋白相比，重组纤连蛋白的表达量不高，纯化工艺效率低、成本高，影响重组纤连蛋白的应用范围。
3、单玉飞等提出一种生物发酵法高效廉价获得重组纤连蛋白的方法(专利号为cn202010438531.4)，该工艺需要在目的蛋白上引入his标签，纯化工艺中使用金属亲和层析填料，并加入特异性蛋白酶将标签全部切除，步骤繁琐，且重组纤连蛋白的生产成本大大增加；cn2018107
4、目前市场上纤连蛋白大部分是提取来源的，分子量较大，透皮能力较弱；调研发现各大研究机构在研的纤连蛋白发酵产量还是克级水平，因此在菌株构建序列的过程中，往往会在纤连蛋白序列基础上做一些优化工作，如加入his标签序列，称为重组类纤连蛋白，但该重组类纤连蛋白安全性低，容易发生过敏等不良反应。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种重组纤连蛋白及其制备、纯化方法和应用。本专利技术首先截取天然纤连蛋白核心活性区域，经密码子优化后，构建一株高表达重组纤连蛋白的菌株，然后找到一种操作简便，成本较低的制备重组纤连蛋白的发酵和纯化技术，适合工业化大规模生产，且制备的纤连蛋白同时在对hacat细胞的粘附作用和弹性蛋白酶抑制方面具有较好的效果，从而具有促进细胞修复和紧致的功效。
2、为实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术的第一个方面，提供一种重组纤连蛋白，重组纤连蛋白选自：
4、(1)seq id no.2所示的氨基酸序列；
5、(2)与seq id no.2所示的氨基酸序列具有90％以上序列一致性的氨基酸序列。
6、本专利技术的第二个方面，提供一种能够编码上述重组纤连蛋白的核酸分子。具体的，所述核酸分子选自：
7、(1)seq id no.1所示的核苷酸序列；
8、(2)与seq id no.1所示的核苷酸序列具有90％以上序列一致性的核苷酸序列。
9、本专利技术的第三个方面，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含第二方面所述的核酸分子，优选为重组表达载体ppic9k-fn。
10、本专利技术的第四个方面，提供一种宿主菌，所述宿主菌含有本专利技术第三方面所述的重组表达载体或染色体整合有本专利技术第二方面所述的核酸分子或者能够表达本专利技术第一方面所述重组纤连蛋白，优选为重组毕赤酵母gs115/ppic9k-fn。
11、本专利技术的第六个方面，提供上述重组纤连蛋白的制备方法，其包括发酵和纯化。
12、其发酵方法为：首先基因工程菌gs115/ppic9k-fn依次通过ypd固体培养基、ypd液体培养基和bmgy培养基进行一级、二级和三级种子液培养，然后采用bsm培养基进行发酵培养，具体为：按照15％-20％的接种量，将培养好的bmgy种子液转入发酵罐开始发酵，控制转速200-800rpm，溶氧≤30％，待ph达到5.05和溶氧上升至60％以上，说明培养基中碳源消耗结束，开始进行连续补料模式；待菌体浓度(od600)达到320-350时，停止补料，使残留的碳源完全消耗掉；待ph和溶氧再次上升后，补加诱导培养基进行表达目的蛋白，诱导表达72h以上，结束发酵，收集发酵液。纯化方法为：对上述所得发酵液进行离心分离，收集上清液，上清液经中空纤维膜过滤后收集透过液，透过液进行盐析除杂蛋白，再用阳离子层析填料(spchromstar ff)进行精纯，超滤脱盐后冻干得到纤连蛋白成品。
13、本专利技术的第七个方面，提供上述重组纤连蛋白在化妆品制备方面的应用，其对hacat细胞的粘附作用和弹性蛋白酶抑制方面具有较好的效果，从而具有促进细胞修复和紧致的功效。
14、本专利技术的有益效果是：
15、1、本申请针对现有技术中重组纤连蛋白制备和纯化困难的问题，通过序列设计、重组菌株构建、发酵、纯化等步骤，得到纯度较高的重组纤连蛋白；相比于市售来源的纤连蛋白，通过本申请得到的重组纤连蛋白具有较高的细胞粘附率，对弹性蛋白酶具有较高的抑制作用，具有较好的应用价值；
16、2、本申请中纯化重组纤连蛋白的工艺较为简单，采用的阳离子层析方法易于操作，成本低，适用于放大生产。
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1.一种重组纤连蛋白，其特征是，其选自：
2.一种能够编码权利要求1所述重组纤连蛋白的核酸分子，所述核酸分子选自：
3.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含权利要求2所述的核酸分子。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征是，所述重组表达载体为重组表达载体pPIC9K-FN。
5.一种宿主菌，所述宿主菌含有权利要求3所述的重组表达载体或染色体整合有权利要求2所述的核酸分子或者权利要求1所述的重组纤连蛋白。
6.如权利要求5所述的宿主菌，其特征是，其为重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-FN。
7.权利要求1所述的重组纤连蛋白的制备方法，其包括发酵和纯化，
8.权利要求1所述的重组纤连蛋白在化妆品制备方面的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征是，通过同时对Hacat细胞的粘附作用和弹性蛋白酶抑制作用，促进细胞修复和紧致。
【技术特征摘要】
1.一种重组纤连蛋白，其特征是，其选自：
2.一种能够编码权利要求1所述重组纤连蛋白的核酸分子，所述核酸分子选自：
3.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含权利要求2所述的核酸分子。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征是，所述重组表达载体为重组表达载体ppic9k-fn。
5.一种宿主菌，所述宿主菌含有权利要求3所述的重组表达载体或染色体整合有权利要求2所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘英杰，黄伟，苏淮，王啸尘，徐佩佩，徐荣荣，杨素珍，王艺纯，石林，刘浩然，
申请(专利权)人：山东福瑞达生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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