【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于电化学检测，涉及一种检测mirna类标志物的电化学传感器及其应用。
技术介绍
1、微小核糖核酸(microrna，mirna)是一类内源性非编码单链rna，长度大约为20个核苷酸。mirna广泛参与了调节免疫系统刺激、脂肪代谢、细胞的增殖、分化和死亡等生物学过程，它的异常调节与心肌梗死、癌症、类风湿关节炎等疾病的发病密切相关，如mir-21在乳腺癌患者的血清中异常表达，循环血液中的mir-499含量在心肌梗死发作后快速升高，mir-146a的表达水平与关节炎相关。因此，检测体液中的mirna对于疾病的诊断、监测和预后具有重大意义。然而，mirna家族内高度相似，以及在不同个体中浓度差异大，使得mirna检测仍是一个巨大的挑战，所以迫切需要开发高灵敏度、高特异性和低成本的检测方法。
2、实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time pcr，qpcr)是mirna含量检测的金标准。但由于mirna的引物序列较短，需要的溶解温度低，降低了qpcr方法的准确性。同时，qpcr仪器昂贵、单次检测成本高且检测时间长，难以开发成即时检测(point-of-care testing，poct)设备。近年来，基于荧光分析法、电化学检测法、电化学发光法及拉曼光谱法等检测mirna的新方法不断出现。其中，利用纳米材料如金属有机框架(metal-organic frameworks,mofs)、金纳米颗粒、脂质纳米颗粒制成的生物传感器在光、电、磁方面良好的特性，可大幅度提高检测mirna的灵敏度、准
3、例如公开号为cn109844514b的专利文献提供了一种非编码rna的电化学传感器的制备方法及其应用，通过一步法制备磺酸化杯芳烃负载的还原氧化石墨烯，用湿热法合成了四氧化三铁纳米材料，并加入金纳米粒子分别合成au@scx8-rgo及au@fe3o4复合材料；通过材料表征确认材料构建成功后，以甲苯胺蓝等物质为电信号物质用丝网印刷电极对目标物进行电化学检测。通过该方法制得的电化学生物传感器可实现了对由选择性多聚腺苷酸化(apa)现象所产生的不同长度的非编码区3'utr转录本表达量的检测。但是大多电化学方法依然面临样品前处理过程繁琐且涉及有毒试剂的问题，不利于方法的应用、推广。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种检测mirna类标志物的电化学传感器及其应用，可以实现mirna类标志物的快速检测，所述mirna类标志物包括肿瘤、心梗和类风湿关节炎等疾病的mirna类标志物，从而有利于相关疾病的早期快速、便捷性检测。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种检测mirna类标志物的电化学传感器，所述电化学传感器包括富集试剂、预处理试剂和传感模块；
4、所述富集试剂包括：如图1a所示，mof载体和适配体fl-apt，所述适配体fl-apt吸附在mof载体表面，所述适配体含有与靶标mirna完全互补配对的核苷酸序列且5’端带有荧光标记分子；其中，所述荧光标记分子为在水溶液中稳定的荧光分子，包括但不限于德克萨斯红texas red(tr)、5(6)-羧基荧光素fam、菁类荧光染料cy3、菁类荧光染料cy5、六氯荧光素hex、四氯荧光素tet、5-羧基四甲基罗丹明tamra；所述mofs为微溶或难溶于水溶液的金属有机框架材料，包括但不仅限于uio-66-nh2、pcn-224、pcn-222、zif-8/67/90、mil-53/88b/101，且所述mofs可以采用水热法、挥发法、扩散合成法、超声法中的任意一种方式合成；进一步优选的，所述富集试剂的制备步骤包括：将浓度为100～500nm的适配体溶液加入浓度不高于300μg/ml的mofs溶液中，静置孵育5～30min后配置获得所述富集试剂。优选的，若所述mofs为uio-66-nh2，mofs溶液的较佳浓度为50μg/ml。
5、所述预处理试剂为浓度不高于6mm的磷酸盐溶液；且优选的，所述磷酸盐为三聚磷酸钠(sodium tripolyphosphate，stpp)、焦磷酸钠(sodiumpyrophosphate，tspp)或六偏磷酸钠(sodium hexametaphosphate，shmp)。
6、所述传感模块的制作步骤包括：如图1b所示，在丝网印刷电极(screen-printedelectrode,spe)表面电化学沉积金纳米颗粒aunps；在电极表面孵育可以捕获fl-apt的巯基dna链即sh-pdna；电极清洗、晾干后，在表面孵育6-巯基己醇(6-mercapto hexanol,mch)；电极清洗、晾干后即可用于检测预处理后的待测液。优选的，所述的sh-pdna为修饰巯基的fl-apt的完全互补配对dna单链；优选的，所述在丝网印刷电极表面电化学沉积金纳米颗粒aunps的步骤为：将spe置于0.1％haucl4溶液中用i-t法沉积aunps；进一步优选的，所述的i-t沉积电位为-0.2v，时间为100～500s；优选的，所述在电极表面孵育可以捕获fl-apt的巯基dna链的步骤为：向电极表面滴涂sh-pdna，在-20℃条件下孵育20～60min，室温下孵育5min。优选的，所述sh-pdna的浓度为50～500nm。优选的，所述mch的浓度为1mm，mch的孵育时间为5～60min。
7、第二方面，本专利技术还提供了上述电化学传感器在制作mirna检测试剂盒中的应用，所述应用包括：富集处理、预处理、传感孵育；
8、所述富集处理步骤为：如图1c所示，将待测样品与所述富集试剂混合，静置孵育5～30min，在此过程中，fl-apt与待测样品中的mirna结合；
9、所述预处理步骤为：如图1d所示，将所述磷酸盐溶液加入上述富集处理后的混合液中，静置孵育5～30min，在此过程中磷酸盐将fl-apt从mof结构上释放，孵育后离心，取上清液作为预处理后的待测液，上清液中含有fl-apt与mirna结合的双链，还包含未与mirna结合的fl-apt单链；
10、所述传感孵育步骤为：如图1e所示，在所述传感模块表面孵育预处理后的待测液，用超纯水洗净后采用循环伏安法(cyclic voltammetry，cv)或差分脉冲伏安法(differential pulse voltammetry，dpv)测试，分别测试孵育待测液前、后spe在[fe(cn)6]3-/4-溶液中产生的电化学信号，根据两者的电化学信号差值δι与mirna浓度的线性关系，计算得到待测样品中mirna的浓度。优选的，所述的[fe(cn)6]3-/4-溶液的浓度为5mm。优选的，所述dpv的测试参数为：扫描范围为-0.2～0.6v，脉冲幅度为0.1v。优选的，所述待测样品中mirna的浓度的测定：选择一系列浓度梯度的mirna标准品溶液，按照所述富集处理、预处理、传感孵育和dpv测试步骤逐一操作，得到对本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测miRNA类标志物的电化学传感器，所述电化学传感器包括富集试剂、预处理试剂和传感模块；
2.如权利要求1所述的一种检测miRNA类标志物的电化学传感器，其特征在于，荧光标记分子为德克萨斯红Texas Red(TR)、5(6)-羧基荧光素FAM、菁类荧光染料Cy3、菁类荧光染料Cy5、六氯荧光素HEX、四氯荧光素TET、5-羧基四甲基罗丹明TAMRA中的任意一种。
3.如权利要求1所述的一种检测miRNA类标志物的电化学传感器，其特征在于，所述MOFs为UiO-66-NH2、PCN-224、PCN-222、ZIF-8/67/90、MIL-53/88B/101中的任意一种。
4.如权利要求1所述的一种检测miRNA类标志物的电化学传感器，其特征在于，所述富集试剂的制备步骤包括：将浓度为100～500nM的适配体溶液加入浓度不高于300μg/mL的MOFs溶液中，静置孵育5～30min后配置获得所述富集试剂。
5.如权利要求1所述的一种检测miRNA类标志物的电化学传感器，其特征在于，所述磷酸盐为三聚磷酸钠STPP、焦磷酸钠T
6.如权利要求1所述的一种检测miRNA类标志物的电化学传感器，其特征在于，所述的SH-pDNA为修饰巯基的FL-apt的完全互补配对DNA单链。
7.如权利要求1所述的一种检测miRNA类标志物的电化学传感器，其特征在于，所述在丝网印刷电极表面电化学沉积金纳米颗粒AuNPs的步骤为：将SPE置于0.1％HAuCl4溶液中用i-t法沉积AuNPs。
8.如权利要求1所述的一种检测miRNA类标志物的电化学传感器，其特征在于，所述在电极表面孵育SH-pDNA的步骤为：向电极表面滴涂SH-pDNA，在-20℃条件下孵育20～60min，室温下孵育5min。
9.如权利要求1所述的一种检测miRNA类标志物的电化学传感器，其特征在于，所述SH-pDNA的浓度为50～500nM；所述MCH的浓度为1mM，MCH的孵育时间为5～60min。
10.权利要求1所述电化学传感器在制作miRNA检测试剂盒中的应用，所述应用包括：富集处理、预处理、传感孵育；
...【技术特征摘要】
1.一种检测mirna类标志物的电化学传感器，所述电化学传感器包括富集试剂、预处理试剂和传感模块；
2.如权利要求1所述的一种检测mirna类标志物的电化学传感器，其特征在于，荧光标记分子为德克萨斯红texas red(tr)、5(6)-羧基荧光素fam、菁类荧光染料cy3、菁类荧光染料cy5、六氯荧光素hex、四氯荧光素tet、5-羧基四甲基罗丹明tamra中的任意一种。
3.如权利要求1所述的一种检测mirna类标志物的电化学传感器，其特征在于，所述mofs为uio-66-nh2、pcn-224、pcn-222、zif-8/67/90、mil-53/88b/101中的任意一种。
4.如权利要求1所述的一种检测mirna类标志物的电化学传感器，其特征在于，所述富集试剂的制备步骤包括：将浓度为100～500nm的适配体溶液加入浓度不高于300μg/ml的mofs溶液中，静置孵育5～30min后配置获得所述富集试剂。
5.如权利要求1所述的一种检测mirna类标志物的电化学传感器，其特征在于，所述磷酸盐为三聚磷酸钠...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁娅，王怀松，孙琦，李睿诚，章钲贤，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：
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