【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及领域，特别涉及一种基于磁性固相萃取的氯吡格雷及其活性代谢物的液相色谱串联质谱检测方法。
技术介绍
1、氯吡格雷及其活性代谢物在血浆样本通常含量极低，达到ng级别，在对其定量检测方法中，最常用的是高效液相色谱法，但仪器检测灵敏度较低，无法满足临床检测需求。此外，高效液相色谱所需的血浆样本量较大，样本前处理所需的时间长，为了在实现目标分析物的所需的检测灵敏度往往需要很长时间的色谱分离，共洗脱的干扰组分对结果的准确度存在很大的影响。由于许多分析方法在灵敏度、选择性及分析速度等方面达不到血浆中氯吡格雷及其活性代谢产物定量分析的要求，限制了其在临床检测上进一步的推广和开展。
2、以色谱作为分离手段，三重四极杆质谱作为检测手段的色谱-质谱联用技术成为了定量检测生物样品中痕量目标分析物的强有力的手段，因此被用于血浆中氯吡格雷及其活性代谢产物的定量检测。专利111812223b报道了一种一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗血小板药物的方法，其中包括氯吡格雷及其羧酸代谢物，羧酸代谢物为氯吡格雷经酯酶水解成的非活性代谢物，不能反应氯吡格雷抑制血小板聚集的功能。同时此方法采用蛋白沉淀法进行前处理，前处理过程特异性差，待测物的回收率低，难以实现自动化。专利118130678a报道了一种检测血液中14种眩晕晕厥类和脑卒中类药物的液相色谱-质谱检测方法，方法中仅检测氯吡格雷，并未提及其代谢物的检测。且前处理过程同样采用蛋白沉淀的方法，相比于磁性固相萃取的方法，检测的过程繁琐，耗时较长。
3、所以，现在有必要对现有
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于磁性固相萃取的氯吡格雷及其活性代谢物的液相色谱串联质谱检测方法。
2、为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种基于磁性固相萃取的氯吡格雷及其活性代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，该方法通过衍生化处理将氯吡格雷的活性代谢物转化为衍生物，然后对该衍生物进行检测，该活性代谢物具有如下式ⅰ所示的化学结构，该衍生物具有如下式ⅱ所示的化学结构：
3、
4、氯吡格雷的活性代谢物转化为衍生物的反应原理如下所示：
5、
6、氯吡格雷的化学结构如下式ⅲ所示：
7、
8、该检测方法包括以下步骤：
9、s1、制备检测样：
10、s1-1、取离心管，向其中加入人全血待测样本和衍生化试剂，混匀，离心，得到血浆样品；
11、s1-2、取步骤s1-1所得血浆样品，加入内标溶液，混匀；
12、s1-3、将磁性固相萃取填料依次进行活化和平衡处理；
13、s1-4、将步骤s1-3所得磁性固相萃取填料加入到步骤s1-2所得产物中，混匀；
14、s1-5、将步骤s1-4中的磁性固相萃取填料转移至第一溶剂中混合；
15、s1-6、将步骤s1-5中的磁性固相萃取填料转移至第二溶剂中混合；
16、s1-7、将步骤s1-6中的磁性固相萃取填料转移至第三溶剂中混合；
17、s1-8、弃步骤s1-7所得产物中的磁性固相萃取填料，剩余溶液作为检测样；
18、s2、构建标准曲线：
19、配置不同浓度的氯吡格雷标准液和衍生物标准液，供液相色谱串联质谱法检测，构建得到氯吡格雷的标准曲线和衍生物的标准曲线；
20、s3、采用液相色谱串联质谱法对检测样进行检测样，结合构建的标准曲线得到检测样中的氯吡格雷含量和衍生物含量。
21、本专利技术的检测原理：
22、药动学研究表明，氯吡格雷本身为前体药物，经代谢转化为活性代谢物(硫醇衍生物)后才发挥抑制血小板聚集的作用。因而需要通过测定血液中的活性代谢药，来反映氯吡格雷的吸收、分布、代谢等疗效。但是由于该药物的体内代谢活性物含量少且稳定性极差，普通体内药物分析方法很难达到要求。本专利技术采用衍生化的方法，将活性代谢物转化为衍生物，然后通过蛋白沉淀进行前处理，涡旋离心取上清进样，采用液相色谱-串联质谱进行检测。
23、其中，活性代谢物和衍生物的比例为1:1，所以检测得到的衍生物的含量就代表了活性代谢物的含量。
24、优选的是，步骤s1-1中的衍生化试剂为2-溴-3'-甲氧基苯乙酮。
25、步骤s1-1具体为：
26、取0.5-2ml人全血待测样本置肝素钠抗凝离心管中加入浓度为400-600mmol/l的2-溴-3'-甲氧基苯乙酮的乙腈溶液5-20μl，涡旋混合0.5-2min，7000-28000rpm下离心2-10min，得到血浆样品。
27、优选的是，步骤s1-1具体为：
28、取1ml人全血待测样本置肝素钠抗凝离心管中加入浓度为500mmol/l的2-溴-3'-甲氧基苯乙酮的乙腈溶液10μl，涡旋混合1min，14000rpm下离心5min，得到血浆样品。
29、优选的是，第一溶剂为去离子水。
30、优选的是，第二溶剂为甲醇。
31、优选的是，第三溶剂为乙腈。
32、优选的是，步骤s1具体为：
33、s1-1、取0.5-2ml人全血待测样本置肝素钠抗凝离心管中加入浓度为400-600mmol/l的2-溴-3'-甲氧基苯乙酮的乙腈溶液5-20μl，涡旋混合0.5-2min，7000-28000rpm下离心2-10min，得到血浆样品；
34、s1-2、取50-100μl步骤s1-1所得血浆样品加入1-4ml的离心管中，加入5-20μl的内标溶液和150-600μl水溶液，500-2000转/min涡旋混合1-4min；内标溶液中包括氯吡格雷内标液和衍生物内标液；
35、s1-3、将1.5-5mg磁性固相萃取填料加入到150-600μl乙腈中进行填料活化，然后将磁性固相萃取填料转移至水中进行填料平衡；
36、s1-4、将步骤s1-3所得磁性固相萃取填料加入到步骤s1-2所得产物中，混匀75-300s；
37、s1-5、将步骤s1-4中的磁性固相萃取填料转移至200-800μl去离子水溶液中，混合60-240s；
38、s1-6、将步骤s1-5中的磁性固相萃取填料转移至200-800μl甲醇中，混合50-200s；
39、s1-7、将步骤s1-6中的磁性固相萃取填料转移至75-300μl的乙腈中，混合50-200s；
40、s1-8、弃步骤s1-7中的磁性固相萃取填料，剩余溶液作为检测样。
41、优选的是，步骤s1具体为：
42、s1-1、取1ml人全血待测样本置肝素钠抗凝离心管中加入浓度为500mmol/l的2-溴-3'-甲氧基苯乙酮的乙腈溶液10μl，涡旋混合1min，14000rpm下离心5min，得到血浆样本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于磁性固相萃取的氯吡格雷及其活性代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，该方法通过衍生化处理将氯吡格雷的活性代谢物转化为衍生物，然后对该衍生物进行检测，该活性代谢物具有如下式Ⅰ所示的化学结构，该衍生物具有如下式Ⅱ所示的化学结构：
2.根据权利要求1所述的基于磁性固相萃取的氯吡格雷及其活性代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，步骤S1-1中的衍生化试剂为2-溴-3'-甲氧基苯乙酮。
3.根据权利要求2所述的基于磁性固相萃取的氯吡格雷及其活性代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，步骤S1-1具体为：
4.根据权利要求1所述的基于磁性固相萃取的氯吡格雷及其活性代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，第一溶剂为去离子水。
5.根据权利要求1所述的基于磁性固相萃取的氯吡格雷及其活性代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，第二溶剂为甲醇。
6.根据权利要求1所述的基于磁性固相萃取的氯吡格雷及其活性代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，第三溶剂为乙腈。
7.根据权利要求1
8.根据权利要求7所述的基于磁性固相萃取的氯吡格雷及其活性代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，步骤S1具体为：
9.根据权利要求1所述的基于磁性固相萃取的氯吡格雷及其活性代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，液相色谱检测条件为：
10.根据权利要求1所述的基于磁性固相萃取的氯吡格雷及其活性代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，质谱条件为：
...【技术特征摘要】
1.一种基于磁性固相萃取的氯吡格雷及其活性代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，该方法通过衍生化处理将氯吡格雷的活性代谢物转化为衍生物，然后对该衍生物进行检测，该活性代谢物具有如下式ⅰ所示的化学结构，该衍生物具有如下式ⅱ所示的化学结构：
2.根据权利要求1所述的基于磁性固相萃取的氯吡格雷及其活性代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，步骤s1-1中的衍生化试剂为2-溴-3'-甲氧基苯乙酮。
3.根据权利要求2所述的基于磁性固相萃取的氯吡格雷及其活性代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，步骤s1-1具体为：
4.根据权利要求1所述的基于磁性固相萃取的氯吡格雷及其活性代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，第一溶剂为去离子水。
5.根据权利要求1所述的基于磁性固相萃取的氯吡格雷及其活性...
【专利技术属性】
技术研发人员：周玉松，李艳，高续瑄，左园，唐雨晴，程文播，
申请(专利权)人：天津国科医疗科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：
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