【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于水稻育种，尤其涉及一种基于kasp多位点检测评价水稻产量的方法。
技术介绍
1、水稻是全球最重要的粮食作物之一，全球每年消耗的水稻量已经达到7亿吨，并且随着人口的增长和经济的发展，对水稻的需求量还会不断增加。水稻增产能够保障全球粮食安全、促进农业产业的发展、增加农民的收入以及促进社会经济的发展。
2、近几年来，利用系谱技术培育出了一批高产的新品种。然而，常规的杂交与回交选择常依赖于较大的种群以及较多的性状鉴定，从而大大提高了育种的投入与费用。随着对水稻关键基因的成功克隆，育种家得以开发出基因功能位点的分子标记，进而分析育种材料内目标性状的基因组合类型，再基于明确的育种优化目标，导入优异基因，从而实现新品种的繁育。此外，在育种的实践中，众多特征如产量等，往往会受到外界环境的干扰，导致其难以进行精确评估。然而，通过分析控制这些特征的关键基因的不同等位基因组合，我们可以进行有效的辨别，这种方法跳脱了表型性状的直接观测，免除了环境因素的干扰，从而提升了选育的精确度，优化了选择过程，进而加快了育种的进程。
3、水稻产量是由数量性状位点控制的。目前，通过遗传分离群体已克隆了多个产量相关基因，如gw8、gnp1、ge、gs3、gl3.2。这些基因序列均存在广泛的自然变异，如gs3编码区第16733441位的碱基变异导致氨基酸变化，依据该snp可将核心种质材料gs3分作两种单倍型，二者存在一定的产量差异；gw8编码区域26501541-26501543的3bp缺失，造成氨基酸翻译移码，导致基因功能丧失。因此
4、kasp基因分型技术是一项独特的竞争型等位基因特异性pcr技术，可对各种基因组核酸样品进行单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism,snp)和indels(insertion deletion)高精度双等位基因分型。kasp技术操作简单，分析稳定、准确，并且成本较低。利用上述5个基因功能位点开发的分子标记，能够对繁殖材料中的产量相关基因位点进行优势等位基因的筛选与优化组合，实现目标有利基因的有效转移与累积，进而提升作物产量。这不仅可以避免传统育种中的盲目性，大幅缩减了所需群体的规模，还节约了成本投入，还大幅提高了选择过程的精准度与工作效率。
技术实现思路
1、本专利技术公开了一种kasp多位点检测和评价水稻产量的方法，具体如下：
2、a.kasp引物设计和特异性检验
3、从博瑞迪生物公司(石家庄)的水稻“核芯一号”液相育种芯片上的位点中，根据基因功能和关联的产量二级性状，获取5个对产量有正向效应的关键snp位点。针对这些位点，设计kasp引物(包含2个上游引物和1个下游引物)，引物由网站primer3设计获得(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)。用网站primer-blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)检验kasp引物的特异性，对于特异性强的引物对，在2个上游引物的5’端分别增加fam(seq id no.18：5’-gaaggtgaccaagttcatgct-3’)和hex(seq id no.19：5’-gaaggtcggagtcaacggatt-3’)荧光序列(分别用f和h代称，公共的下游引物以c代称)获得最终kasp引物。合成kasp引物，分别以f+c和h+c为上下游引物组合、以“日本晴”水稻叶片dna为扩增模板，进行pcr扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，要求扩增条带大小符合预期、特异性强(条带单一，不弥散，不拖尾)，方可用于后续kasp检测。
4、b.根据表型和基因型数据选择检测材料
5、根据水稻群体材料的“产量三要素”表型数据(单株有效穗数、每穗粒数、千粒重)，通过公式“单株模拟产量＝单株有效穗数×每穗粒数×千粒重÷1000”计算所有材料的单株模拟产量，其中单株有效穗数、每穗粒数、千粒重是通过已报道数据或者小面积种植计算获得。按照单株模拟产量从高到低排序，分别从前1/3、中间1/3和后1/3中选择高产、中产和低产材料各8份，分别形成“高产组”、“中产组”和“低产组”；选择标准为每组8份材料的单株模拟产量尽量不要过于接近、来源地尽量不相同、材料类型尽量包含地方材料(landrace)和育种材料(breeding line)两种，以保证所选材料对水稻群体材料的代表性。上述24份材料作为后续验证所设计kasp准确性的检测材料。
6、c.kasp引物分型效果验证
7、“a.kasp引物设计和特异性检验”中所选5个位点对水稻产量有一定正向效应，因此可通过统计材料中突变位点的数量，推测该材料的产量，规则如下：统计材料中突变位点的数量，若某个位点发生纯合突变计数为1，发生杂合突变计数为0.5，未发生突变计数为0；若某个材料在5个位点中突变位点数量≥4.5，则推测为高产材料，＞3且＜4.5推测为中产材料，≤3推测为低产材料。
8、所述kasp的扩增体系和扩增条件如下：
9、使用2×master mix foraspcr试剂盒(成都瀚辰光翼科技有限公司)，配置10μlpcr体系(5μlmix，f和h均0.1μl，c为0.3μl，3.5μldepc水；50ng/μl样品dna 1μl)，pcr程序为：预变性95℃10min；循环2(变性95℃20s，退火/延伸61℃-55℃(-0.6℃/循环)40s)进行10次；循环3(变性95℃20s，退火/延伸55℃40s)进行27次(若聚类不够明显可增加1-3次)；荧光扫描30℃30s。
10、取“b.测定代表材料的田间产量”中24份材料的叶片，tps法提取gdna(wang等，2020)。将提取的gdna浓度调整为50ng/μl，用2×master mix foraspcr试剂盒(成都瀚辰光翼科技有限公司，货号hc-1011)和“a.kasp引物设计和特异性检验”5个位点设计的kasp引物，对24份材料gdna进行kasp-pcr。用kasp酶标仪(polarstar omega全自动多功能酶标仪)和klustercaller软件分析对照材料的分型结果，若材料分群边界明显，则该对kasp引物初步认定可用于检测。
11、kasp结果图中，材料聚类为红点区(靠y轴)、绿点区(xy轴角平分线)和蓝本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于KASP多位点检测评价水稻产量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测水稻为籼稻。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中通过KASP确定待测水稻GW8基因、GNP1基因、GE基因、GS3基因和GL3.2基因的基因型。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中检测待测水稻GW8基因、GNP1基因、GE基因、GS3基因和GL3.2基因的KASP引物分别为SEQ ID NO.1-3、SEQ ID NO.4-6、SEQ ID NO.7-9、SEQ ID NO.10-12、SEQ ID NO.13-15；其中SEQ ID NO.1-2、4-5、7-8、10-11、13-14为特异引物，SEQ ID NO.3、6、9、12、15为通用引物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述KASP的扩增体系为：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述样品DNA的浓度为50ng/μL。
7.根据权利要求6所述的方
8.权利要求1-7任一项所述的方法在鉴定水稻是否高产中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述水稻为籼稻。
...【技术特征摘要】
1.一种基于kasp多位点检测评价水稻产量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测水稻为籼稻。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中通过kasp确定待测水稻gw8基因、gnp1基因、ge基因、gs3基因和gl3.2基因的基因型。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中检测待测水稻gw8基因、gnp1基因、ge基因、gs3基因和gl3.2基因的kasp引物分别为seq id no.1-3、seq id no.4-6、seq id no.7-9、seq id no.10-12、seq id no.13-15；其中seq id no.1-2...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈任佳，吴中正，郭涛，王慧，刘永柱，陈淳，王加峰，肖武名，黄明，杨瑰丽，黄翠红，周丹华，胡朝旭，王键宽，吴满，叶珊，陈志强，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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