【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药材料，尤其是涉及一种再生人源i型胶原蛋白、医用材料及其制备方法。
技术介绍
1、胶原蛋白又称胶原，是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质，约占体内蛋白总量的25～30％。其广泛存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织的重要结构蛋白，起着稳定组织和器官并维持其结构完整的作用。此外，胶原蛋白可以给予含有胶原蛋白的皮肤层所必需的养分，使皮肤中的胶原蛋白活性加强，保持角质层水分以及纤维结构的完整性，改善皮肤细胞生存环境和促进皮肤组织的新陈代谢，增加循环，达到滋润皮肤延缓老化，美容，消皱，养发的目的。
2、传统的胶原蛋白生产方法是利用酸、碱或酶来处理动物组织(猪皮、牛皮、驴皮、鱼皮/鳞等)，从中提取胶原蛋白。这些方法虽然成本低廉，但是由于来源于动物，存在动物免疫源性和病毒残留的风险，植入人体之后可能会引发异源的排异反应和动物源病毒引入人体的风险，限制了其作为生物材料在医疗器械等领域的应用；并且这些方法的量产均一性和稳定性很难保证，因为不同地区不同年龄的动物的表皮厚度均一性差距较大，在后续的处理及应用时会影响产品的批间稳定性和一致性。
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种再生人源i型胶原蛋白、医用材料及其制备方法。
2、本专利技术的第一方面，提出了一种再生人源i型胶原蛋白的制备方法，其包括以下步骤：
3、s11、将来源于人的皮肤细胞或间充质干细胞进行体外分离和增殖
4、s12、将细胞接种到增殖培养基中进行静态培养；而后在促分泌蛋白培养基中进行动态培养；所述促分泌蛋白培养基包括基础培养基和因子；所述促分泌蛋白培养基中的因子包含20ug/ml～60ug/ml的抗坏血酸磷酸酯镁盐，0.02ug/ml～0.05ug/ml的糖皮质激素，0.02ug/ml～0.06ug/ml的胰岛素转铁蛋白。
5、根据本专利技术实施例再生人源i型胶原蛋白的制备方法，至少具有以下有益效果：该方法制备的i型胶原蛋白来源于人，可有效消除动物源胶原蛋白所存在的免疫源性和病毒残留的风险；该制备方法具体操作可控，有利于消除批次间差异，保证量产均一性和稳定性。在具体制备过程中，先将体外分离和增殖培养得到的细胞接种到增殖培养基中进行静态增殖培养，而后更换到含特定因子的促分泌蛋白培养基中进行动态培养，一方面，促分泌蛋白培养基中的因子糖皮质激素可以有效抑制细胞的增殖分裂，因子抗坏血酸磷酸酯镁盐和胰岛素转铁蛋白可以有效促进细胞分泌胶原蛋白，利用这三种因子对细胞的刺激作用可使其更好的促进氨基酸合成和分泌胶原蛋白，提高i型胶原蛋白的得率。
6、步骤s11中，具体可采用组织工程的方式将来源于人的皮肤细胞或间充质干细胞进行体外分离和增殖培养，以作为后续生产片状组织的原材料。
7、步骤s12中，可将细胞接种到经贴壁tc处理的组织培养器中进行培养，组织培养器可为1～50层，例如可为1层、3层、5层、8层、10层、15层、20层、22层、25层、28层、30层、35层、40层、46层、50层等。组织培养器设计为长方体容器、正方体容器、圆柱体容器或其他形状容器。
8、在本专利技术的一些实施方式中，步骤s12中，细胞接种到增殖培养基中的初始接种密度为6000～20000个细胞/cm2。进一步地，细胞初始接种密度可为8000～16000个细胞/cm2、10000～20000个细胞/cm2或10000～15000个细胞/cm2。
9、在本专利技术的一些实施方式中，步骤s12中，静态培养时间为2～4天，例如可以是2天、2.5天、3天或4天。
10、在本专利技术的一些实施方式中，增殖培养基可采用促进增殖型培养基试剂盒，采用该试剂盒进行培养，显微镜下观察细胞融合度达到95％以上。
11、增殖培养基中给予促进细胞增殖的细胞生长因子，在增殖培养基中静态培养过程，细胞增殖分裂迅猛；静态培养结束后，更换为促分泌蛋白培养基培养，通过该培养基给予有效分泌胶原蛋白的细胞生长因子。
12、在本专利技术的一些实施方式中，促分泌蛋白培养基中抗坏血酸磷酸酯镁盐的用量可为25ug/ml～50ug/ml、30ug/ml～40ug/ml或40ug/ml～60ug/ml；糖皮质激素的用量可为0.03ug/ml～0.05ug/ml或0.02ug/ml～0.04ug/ml；胰岛素转铁蛋白的用量可为0.03ug/ml～0.05ug/ml或0.04ug/ml～0.06ug/ml。
13、在本专利技术的一些实施方式中，所述促分泌蛋白培养基中的因子还包含：30mg/ml～70mg/ml质量比为1:1:1:1:1:1的甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸、羟脯氨酸和甲硫氨酸，和/或，2wt.％～10wt.％的胎牛血清或者血清替代物。
14、在本专利技术的一些实施例方式中，所述促分泌蛋白培养基中，质量比为1:1:1:1:1:1的甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸、羟脯氨酸和甲硫氨酸的用量可为35mg/ml～50mg/ml、40mg/ml～60mg/ml或50mg/ml～70mg/ml；胎牛血清或者血清替代物的用量可为4wt.％～8wt.％、3wt.％～7wt.％或5wt.％～10wt.％。
15、在本专利技术的一些实施方式中，促分泌蛋白培养基中的因子包含25ug/ml的抗坏血酸磷酸酯镁盐，36mg/ml质量比为1:1:1:1:1:1的甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸、羟脯氨酸和甲硫氨酸，0.025ug/ml的糖皮质激素，0.025ug/ml的胰岛素转铁蛋白，3wt.％的胎牛血清或者血清替代物。
16、在本专利技术的一些实施方式中，步骤s12中，所述基础培养基选自dmem培养基和/或mem培养基；且/或，所述糖皮质激素选自倍他米松、甲基强的松龙、地塞米松、氯地米松中的至少一种。
17、更换为促分泌蛋白培养基后，可通过开启培养基循环体系进行动态培养，此时细胞不再迅猛增殖分裂，而基本维持现有细胞量，开始在促分泌培养基和循环动态培养基的刺激下细胞大量分泌胶原蛋白，并呈现出叠加式分泌的效果，进而可得到富含胶原蛋白的组织。
18、在本专利技术的一些实施方式中，步骤s12中，所述动态培养为循环动态培养，包括：每隔2～7天进行一次培养基的更换，同时在动态培养的第2～7天开始控制培养基循环流动，给予循环流动培养基的刺激。进一步地，更换培养基的时间间隔可控制为3～6天。
19、在本专利技术的一些实施方式中，控制培养基循环流动过程，可控制第一次换液的流速为5rpm～15rpm，第二次换液的流速为15rpm～30rpm，第三次换液的流速为20rpm～40rpm，以促进胶原蛋白的分泌和组织的生成。
20、在本专利技术的一些实施方式中，控制培养基循环流动过程，可控制第一次换液的流速为7rpm，第二次换液的流速为20rpm，第三次换液的流速为36rpm。
21、在本专利技术的一些实施方式中，所述静态培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种再生人源I型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述再生人源I型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述促分泌蛋白培养基中的因子还包含：30mg/mL～70mg/mL质量比为1:1:1:1:1:1的甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸、羟脯氨酸和甲硫氨酸，和/或，2wt.％～10wt.％的胎牛血清或者血清替代物。
3.根据权利要求1所述再生人源I型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S12中，细胞接种到增殖培养基中的初始接种密度为6000～20000个细胞/cm2；且/或，静态培养时间为2～4天。
4.根据权利要求1所述再生人源I型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S12中，所述基础培养基选自DMEM培养基和/或MEM培养基；且/或，所述糖皮质激素选自倍他米松、甲基强的松龙、地塞米松、氯地米松中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的再生人源I型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S12中，所述动态培养为循环动态培养，包括：每隔2～7天进行一次培养基的更换，同时在动态培养的第2～7天开始控制培养基循环流动
6.根据权利要求1至5任一项所述再生人源I型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，还包括：S13、收集胶原蛋白。
7.根据权利要求6所述再生人源I型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S13中，通过原位脱细胞处理收集胶原蛋白。
8.一种再生人源I型胶原蛋白，其特征在于，由权利要求1至7任一项所述再生人源I型胶原蛋白的制备方法制得。
9.一种医用材料，其特征在于，包括：左旋聚乳酸微球和负载在所述左旋聚乳酸微球表面的功能性包覆层，所述功能性包覆层包含胶原蛋白，所述胶原蛋白为权利要求8所述的再生人源I型胶原蛋白。
10.根据权利要求9所述的医用材料，其特征在于，还包括促吸附层；所述促吸附层设于所述左旋聚乳酸微球和所述功能性包覆层之间；
11.根据权利要求10所述的医用材料，其特征在于，所述促吸附层为聚乙烯亚胺层、聚多巴胺层、磷酸钙层中的任一种；
12.权利要求9至11任一项所述医用材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
13.根据权利要求12所述医用材料的制备方法，其特征在于，步骤S22中，将左旋聚乳酸微球粉末与所述包覆浆料混合之前，先在左旋聚乳酸微球粉末中的左旋聚乳酸微球表面负载促吸附层。
...【技术特征摘要】
1.一种再生人源i型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述再生人源i型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述促分泌蛋白培养基中的因子还包含：30mg/ml～70mg/ml质量比为1:1:1:1:1:1的甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸、羟脯氨酸和甲硫氨酸，和/或，2wt.％～10wt.％的胎牛血清或者血清替代物。
3.根据权利要求1所述再生人源i型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤s12中，细胞接种到增殖培养基中的初始接种密度为6000～20000个细胞/cm2；且/或，静态培养时间为2～4天。
4.根据权利要求1所述再生人源i型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤s12中，所述基础培养基选自dmem培养基和/或mem培养基；且/或，所述糖皮质激素选自倍他米松、甲基强的松龙、地塞米松、氯地米松中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的再生人源i型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤s12中，所述动态培养为循环动态培养，包括：每隔2～7天进行一次培养基的更换，同时在动态培养的第2～7天开始控制培养基循环流动；
6.根据权利要求1至5任一项所述再生...
【专利技术属性】
技术研发人员：成诗宇，常峻玮，
申请(专利权)人：柔脉医疗深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：
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