【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于化学物环境毒理及风险评价领域，具体涉及双酚类物质暴露的外源标志物及其在人体内负荷监测中的应用。
技术介绍
1、双酚a是一类广泛使用的合成化学品，被广泛用于合成聚碳酸酯和环氧树脂等材料，并用于制造塑料瓶、幼儿用的吸口杯、食品和饮料罐内侧涂层。然而，近年来越来越多的研究表明，低剂量双酚a暴露与众多内分泌干扰和代谢干扰效应相关，是乳腺癌、神经退行性疾病等发生的重要危险因素。因此，双酚a被逐渐禁用和替代，由此衍生出一大类双酚类替代品(bps)，包括双酚af(bpaf)、双酚b(bpb)和双酚ap(bpap)等。
2、体外细胞和动物实验研究表明，这些bps可能具备比双酚a更高的毒性，这引发了广泛的健康忧虑。然而，这些bps的人群暴露健康效应极少被关注，主要原因之一是他们在人体生物样品如血清和尿液中的检出率和检出浓度不高，从而难以进行统计学关联分析。
3、值得注意的是，近年来国内外湖泊和流域水体监测研究表明，水中bps含量与双酚a浓度相当甚至更高。然而，人群暴露监测研究表明多数bps的检出率和检出浓度均低于双酚a。造成外环境与人群内暴露监测数据不一致的原因可能是双酚类物质进入体内后能被快速代谢转化，仅测定母体化合物可能会造成巨大的暴露评估偏差。
4、双酚类物质从结构上来看不属于持久性有机污染物，其进入体内后，可在细胞色素p450氧化酶等作用下发生i相代谢转化。活性i相代谢转化可与蛋白质和核酸形成加合物造成细胞毒性，也可进一步通过ii相代谢直接转化为水溶性的结合物，以减少毒性并促进排泄。这些过
5、暴露标志物是精准重构污染物暴露水平的关键，是连接环境污染物和健康效应的桥梁。目前，对人体血清bps暴露水平的定量评估通常是通过比较血清中母体bps的浓度来进行的。这种评估方式是默认了bps进入体内后主要以母体bps形式存在。然而，若bps进入体内后能快速代谢转化，母体化合物浓度无疑会远低于其代谢转化产物浓度，则仅通过测定母体bps来评估暴露量会造成评估结果严重低估。因此，亟需开展研究，建立bps暴露标志物识别方法，厘清bps体内代谢转化规律，以提供可供人体bps内负荷监测的暴露标志物。
技术实现思路
1、目前研究多使用血清或尿液中的母体bps来评估双酚类物质的内负荷量，忽视了bps体内代谢转化过程，导致暴露评估不确定性高，为此，本专利技术旨在提供双酚类物质暴露的外源标志物及其在人体内负荷监测中的应用，厘清bps体内代谢转化规律，快速提供可供人群内负荷监测的暴露标志物。
2、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
3、一种筛选双酚类物质暴露的外源标志物的方法，包括以下步骤：
4、(1)动物染毒暴露、血清获取及数据采集：将实验动物灌胃给与双酚类物质，暴露(给药)浓度50～400mg/kg/day，暴露时间15天以上；暴露结束后，获取实验动物血清，净化血清，获得分析样品；使用超高效液相色谱串联四极杆/轨道阱高分辨质谱仪对样品进行分析测定，采集到若干碎片离子图谱；
5、所述的实验动物包括啮齿类或非啮齿类动物；
6、所述的啮齿类动物优选大鼠和小鼠；
7、所述的非啮齿类动物优选兔、狗、猴，或其他；
8、所述的双酚类物质包括双酚a及其替代品；
9、所述的双酚a替代品包括双酚af(bpaf)、双酚b(bpb)和双酚ap(bpap)；
10、所述的获取实验动物血清，是在暴露结束后，实验动物禁食12小时以上，麻醉，进行腹切以从腹主动脉采集血液，离心以获取血清；
11、(2)筛选潜在标志物：依据双酚类物质可能发生的i相和ii相代谢转化反应，形成潜在暴露标志物清单(generate expected compounds)；使用compounddiscoverer软件对步骤(1)采集到的碎片离子图谱进行自动化筛查工作流程，包括：峰提取(selectspectra)、峰对齐(align retention times)、期望化合物筛查(find expectedcompounds)、期望化合物组合(group expected compounds)、化合物鉴定和注释以及碎片离子搜索评分(fish scoring)；将碎片离子得分高的母离子与暴露标志物清单进行匹配，筛选出潜在的双酚类物质暴露标志物的分子式；
12、所述的i相代谢转化反应共7种，包括氧化、还原、水解、还原脱氟、氧化脱氟等；所述的ii相代谢转化反应共17种，包括乙酰化、甲基化、葡糖苷酸缀合、硫酸盐化作用、谷胱甘肽缀合、甘氨酸结合、半胱氨酸偶联等；设定i相和ii相代谢反应的最大反应次数分别为2，总反应次数为3，通过代谢反应组合，形成潜在暴露标志物清单(generate expectedcompounds)(包含数千种潜在暴露标志物)；
13、(3)结构解析：使用代谢模拟软件，计算双酚类物质不同位点反应所需的能量，从而明确代谢反应的潜在靶点，依据步骤(2)得到的分子式初步推算出其结构式；随后，把推断出的结构式输入至compounddiscoverer软件，利用碎片离子搜索算法，自动模拟化合物的特征质谱碎片图谱，计算实际采集到的碎片离子与理论产生(软件算出)的碎片离子间的相似度，匹配度>20％的确定为暴露标志物的结构式；此外，根据暴露标志物的峰面积强度进行半定量分析，以明确灵敏性暴露标志物；
14、所述的代谢模拟软件包括admet predictortm和biotransformer 3.0。
15、双酚类物质暴露的外源标志物，其结构式如下表所示：
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20、所述的双酚类物质暴露的外源标志物可以应用于双酚类物质在人体的内负荷监测，应用于评估双酚类物质暴露毒性效应等等。
21、本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：
22、1、本专利技术基于双酚类物质的i相和ii相代谢转化规律系统构建其血清暴露标志物清单，并结合高分辨信息采集和碎片离子搜索评分结果实现双酚类物质暴露的外源性标志物的全覆盖筛查。
23、2、本专利技术通过代谢模拟计算双酚类物质不同位点反应所需的能量以明确代谢反应的潜在靶点，并用碎片离子搜索算法自动模拟化合物的特征质谱碎片图谱以计算实际采集到的碎片离子与理论产生的碎片离子间的相似度，依据匹配度确定暴露标志物的结构式，最终实现双酚类物质暴露的外源性标志物的精确结构解析。
24、3、本专利技术依据i相和ii相代谢转化产物厘清bps体内代谢转化规律，并依据暴露标志物的峰面积强度进行半定量分析，确立了可供人体内负荷监测的高灵敏性暴露标志物。
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1.一种筛选双酚类物质暴露的外源标志物的方法，其特征在于包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的双酚类物质包括双酚A及其替代品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的双酚A替代品包括双酚AF、双酚B和双酚AP。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的Ⅰ相代谢转化反应共7种，所述的Ⅱ相代谢转化反应共17种；设定Ⅰ相和Ⅱ相代谢反应的最大反应次数分别为2，总反应次数为3，通过代谢反应组合，形成潜在暴露标志物清单。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述的代谢模拟软件包括ADMETPredictorTM和BioTransformer 3.0。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的实验动物包括啮齿类或非啮齿类动物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的啮齿类动物包括大鼠和小鼠。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的获取实验动物血清，是在暴露结束后，实验动物禁食12小时以
9.双酚类物质暴露的外源标志物，其特征在于：结构式如下表所示：
10.权利要求9所述的双酚类物质暴露的外源标志物在人体内负荷监测中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种筛选双酚类物质暴露的外源标志物的方法，其特征在于包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的双酚类物质包括双酚a及其替代品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的双酚a替代品包括双酚af、双酚b和双酚ap。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的ⅰ相代谢转化反应共7种，所述的ⅱ相代谢转化反应共17种；设定ⅰ相和ⅱ相代谢反应的最大反应次数分别为2，总反应次数为3，通过代谢反应组合，形成潜在暴露标志物清单。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述的代谢模拟软件包括adme...
【专利技术属性】
技术研发人员：邝洪轩，李振驰，于云江，向明灯，胡国成，周洋，
申请(专利权)人：生态环境部华南环境科学研究所生态环境部生态环境应急研究所，
类型：发明
国别省市：
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