【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物病毒基因工程，具体涉及一种新德里番茄曲叶病毒表达载体及其构建方法和应用。
技术介绍
1、新德里番茄曲叶病毒(tomato leaf curl new delhi virus，tolcndv)是一种双生病毒，属于菜豆金色花叶病毒属。其主要侵染茄科作物和葫芦科作物，通过烟粉虱进行持久性传毒，其侵染寄主后引起严重的叶片卷曲、幼叶叶脉肿胀、节间缩短、果实缩小及果皮粗糙等症状，严重影响作物的产量和品质。
2、新德里番茄曲叶病毒的基因组由dna-a和dna-b两条大小相似的单链环状dna组成。dna-a编码蛋白av1、av2、ac1、ac2、ac3和ac4，其中av1为病毒的外壳蛋白；av2是一个假定的移动蛋白，可能具有rna沉默抑制子功能；ac1为病毒复制相关蛋白；ac2为转录激活因子；ac3为复制增强因子：ac4可能为症状决定因子和rna沉默抑制子。dna-b组分含有2个orf，即bv1和bc1，分别编码病毒的核穿梭蛋白和运动蛋白。与其他双生病毒类似，tolcndv编码的大多数蛋白都具有多种功能，通过利用寄主因子完成复制、转录、运动等生活史，或通过不同方式逃脱植物的抗病毒防御反应而促进病毒侵染。
3、植物病毒病一直危害着农业的生产，将植物病毒改造为植物病毒表达载体受到广泛关注。植物病毒表达载体具有表达水平高、增殖速度快、易于遗传操作、宿主范围广和外源蛋白易于纯化和保存等优点，使它在外源蛋白的表达应用方面非常受欢迎。但由于新德里番茄曲叶病毒致病力强，一旦感病可能会导致植株生长停滞甚至死亡，将其改造
技术实现思路
1、针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种新德里番茄曲叶病毒表达载体及其构建方法和应用。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术的第一方面，提供一种新德里番茄曲叶病毒表达载体，包括：基础载体，插入到基础载体中的新德里番茄曲叶病毒dna-a的长基因间隔区、ac1、ac4、ac2、ac3，以及camv 35s启动子和nos终止子。
4、所述基础载体为农杆菌双元表达载体，优选为phse401载体。
5、本专利技术将来自于新德里番茄曲叶病毒dna-a的长基因间隔区、ac1、ac4、ac2、ac3插入到基础载体中，其中，ac1复制相关蛋白，是双生病毒复制所必需的，与长基因间隔区的复制结合位点相结合；ac3复制增强蛋白，提高复制效率；长基因间隔区含包含复制结合位点，同时也是转录起始的位置。camv 35s启动子和nos终止子之间用于插入目的基因，以用于目的蛋白的表达。
6、本专利技术的新德里番茄曲叶病毒表达载体，其通过关键基因区段的选择和组合，既能保证所构建的病毒表达载体能够在植物体内正常复制，又不会导致植株生长停滞或死亡，从而为外源蛋白的表达奠定了基础。
7、本专利技术的第二方面，提供上述新德里番茄曲叶病毒表达载体的构建方法，包括以下步骤：
8、(1)以新德里番茄曲叶病毒基因组dna-a为模板，分别扩增长基因间隔区片段、长基因间隔区-ac1-ac4-ac2-ac3片段；
9、(2)扩增camv 35s启动子-nos终止子片段，将长基因间隔区片段和camv 35s启动子-nos终止子片段通过融合pcr连接，得到lir-camv 35s-nos片段；将lir-camv 35s-nos片段和长基因间隔区-ac1-ac4-ac2-ac3片段连接到基础载体上，构建得到新德里番茄曲叶病毒表达载体。
10、优选的，步骤(1)中，所述长基因间隔区片段的核苷酸序列如seq id no.3所示；长基因间隔区-ac1-ac4-ac2-ac3片段的核苷酸序列如seq id no.4所示。
11、优选的，步骤(2)中，camv 35s启动子-nos终止子片段的核苷酸序列如seq idno.5所示。
12、本专利技术的第三方面，提供含有上述新德里番茄曲叶病毒表达载体的重组菌。
13、优选的，所述重组菌为转入上述新德里番茄曲叶病毒表达载体的农杆菌。
14、本专利技术的第四方面，提供上述新德里番茄曲叶病毒表达载体或者含有新德里番茄曲叶病毒表达载体的重组菌在提高外源蛋白的表达量中的应用：
15、本专利技术的第五方面，提供一种提高外源蛋白表达量的方法，包括以下步骤：
16、将编码外源蛋白的目的基因插入到新德里番茄曲叶病毒表达载体的camv 35s启动子和nos终止子片段之间，构建得到重组表达载体；将重组表达载体转化农杆菌，获得重组菌；利用重组菌侵染植物，收集侵染后植物的叶片，提取、纯化外源蛋白。
17、利用本专利技术的新德里番茄曲叶病毒表达载体，可以根据需要生产任意的外源蛋白。本专利技术中以gfp基因和fluc基因为例，研究重组载体高效表达蛋白的能力，并不限制待表达的基因。
18、优选的，所述植物为本氏烟或辣椒。
19、本专利技术的有益效果：
20、1、本专利技术以phse401载体为基础，按顺序依次连接有长基因间隔区、camv 35s启动子、gfp基因、nos终止子、ac3、ac2、ac4、ac1、长基因间隔区，构建了新德里番茄曲叶病毒表达载体。所得的重组载体可以显著提高目的蛋白的表达量，获得了一种快速、高效表达目的蛋白的表达系统，在理论研究和生产应用方面都有着重要的作用。
21、2、本专利技术的重组载体可以高效表达目的蛋白，可以用于研究蛋白的功能、作用机制等，为理论研究提供了高效表达系统，奠定了良好基础。
22、3、本专利技术重组载体可以在本氏烟、辣椒等新德里番茄曲叶病毒寄主植物中高效表达目的蛋白，可用于研究其寄主植物蛋白功能。
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1.一种新德里番茄曲叶病毒表达载体，其特征在于，包括：基础载体，插入到基础载体中的新德里番茄曲叶病毒DNA-A的长基因间隔区、AC1、AC4、AC2、AC3，以及CaMV 35S启动子和NOS终止子。
2.根据权利要求1所述的新德里番茄曲叶病毒表达载体，其特征在于，所述基础载体为pHSE401载体。
3.权利要求1或2所述的新德里番茄曲叶病毒表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述长基因间隔区片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；长基因间隔区-AC1-AC4-AC2-AC3片段的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，CaMV 35S启动子-NOS终止子片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
6.含有权利要求1或2所述的新德里番茄曲叶病毒表达载体的重组菌。
7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为转入新德里番茄曲叶病毒表达载体的农杆菌。
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