【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及单细胞测序分析，尤其涉及一种循环肿瘤细胞单细胞测序分析方法。
技术介绍
1、随着细胞生物学和测序技术的不断发展，循环肿瘤细胞(ctc)的检测与单细胞测序已经成为癌症诊断和精准治疗的重要工具。目前ctc分选技术与单细胞测序技术的结合面临诸多挑战，其中包括细胞富集效率不足、细胞损伤、样本损失以及难以高效整合多步骤操作的问题。
2、现有ctc分选与单细胞测序技术主要包括以下几种：
3、1.磁珠分选技术：利用磁珠表面结合的特异性抗体捕获ctc，通过外部磁场实现分离。优势：特异性高，可有效分离稀有ctc。不足：依赖抗体标记，可能漏检抗原表达较低的ctc；分选后需额外纯化步骤，难以与单细胞测序直接整合。
4、2.基于物理特性的分选：包括惯性聚焦、尺寸筛选和密度梯度离心等。优势：无标记分选，操作简便。不足：在ctc含量极低的样本中，难以实现高纯度分选。
5、3.流式细胞术分选：利用荧光标记ctc的特异性抗原，通过流式细胞仪分选。优势：高分辨率，高纯度。不足：操作复杂，设备昂贵；难以直接与微流控和单细胞测序结合。
6、4.声学分选技术(现有技术中的创新方向之一)：通过声场对不同细胞施加不同的声学辐射力，实现细胞分离。优势：无标记、温和处理，避免细胞损伤。不足：设备参数需要精准设计。声学分选目前多应用于样本富集环节，未能与单细胞测序有效整合。
7、现有技术存在以下共性问题：
8、1.样本损失：ctc分选和转移的多步操作导致细胞丢失，特别是ctc这种稀
9、2.整合性不足：难以将ctc分选与单细胞测序在同一平台上实现无缝整合。
10、3.细胞活性受损：部分分选技术(如磁珠分选、流式细胞术)可能引起细胞损伤，影响后续分析。
11、4.复杂性和成本高：分选技术与测序准备多为独立步骤，增加了实验复杂性和时间成本。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种循环肿瘤细胞单细胞测序分析方法。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
3、一种循环肿瘤细胞单细胞测序分析方法，基于测序分析系统实现，该系统包括但不限于：
4、声学分选模块、液滴生成模块；
5、还包括：
6、s1孔，s1孔为样本注入孔，用于注入样本，s1孔连接a通道，用于输送循环肿瘤细胞的血液样本；
7、s2孔，s2孔为dna标签注入孔，用于dna标签注入，s2孔连接e通道，用于输送带有dna标签的胶球；
8、s3孔，s3孔为扩增试剂注入孔，用于扩增试剂注入，s3孔连接f通道，用于输送扩增试剂；
9、s4孔，s4孔为切割油注入孔，用于切割油注入，s4孔连接h通道，用于输送切割油；
10、s5孔，s5孔为ctc回收孔，用于ctc回收，s5孔连接i通道，i通道为液滴生成通道；
11、s6孔，s6孔为背景细胞回收孔，用于背景细胞回收，s6孔连接d通道，用于输送背景细胞；
12、其中，所述a通道经过声学分选模块后连接c通道和d通道，c通道为循环肿瘤细胞分选通道；c通道的一端与e通道、f通道和g通道连通，g通道的一端与i通道连通，h通道与g通道连通；
13、所述声学分选模块进行ctc分选与富集，声学分选模块的微流控通道两侧集成超声换能器和反射层，形成稳定的驻波声场，基于声学分选模块声场频率和功率调节，使ctc因其较大的体积和密度受声学辐射力作用而聚焦到通道侧壁；
14、所述液滴生成模块进行单细胞包裹，其中，分选后的ctc通过c通道与e通道输入的dna条形码胶球和f通道输入的扩增试剂混合，在g通道结合后，被h通道输入的油相切割成液滴。
15、优选的：所述测序分析系统中：
16、血液样本从a通道注入；
17、在b区域布置驻波场中，ctc偏移至c通道出口，背景细胞进入d通道排出。
18、优选的：所述测序分析系统中，每个液滴包含一个ctc、一个dna条形码胶球和扩增试剂；
19、液滴大小控制在50-100μm，确保单细胞分离。
20、优选的：所述测序分析系统中，液滴内扩增与测序准备，具体如下：
21、液滴中的扩增试剂启动细胞裂解、逆转录及扩增反应；
22、最终产物直接用于高通量单细胞测序。
23、优选的：包括如下步骤：
24、步骤a：样本处理与预处理；
25、步骤b：声学分选；
26、步骤c：液滴生成；
27、步骤d：液滴收集与扩增；
28、步骤e：测序准备与分析。
29、优选的：所述步骤a具体包括：
30、a1样本采集：
31、从患者外周血采集10ml血液至edta抗凝管中，确保无凝集发生；
32、样本采集后尽量在2小时内完成处理，避免细胞降解；
33、a2：样本离心与分层：
34、将血液样本以1200×g离心10分钟，室温操作；
35、去除上清血浆，保留白细胞层，稀释至10ml的1×pbs(无钙镁)；
36、a3：细胞过滤：
37、使用70μm细胞过滤器过滤稀释样本，去除大颗粒杂质和聚集的细胞团块，保证后续分选效果；
38、收集滤过液备用，避免样本过长时间暴露在空气中。
39、优选的：所述步骤b具体包括：
40、b1：系统初始化：
41、开启声学分选模块，设置超声频率为2mhz和功率0.5w/cm2；
42、校准流速：样本流速设置为20μl/min，对照流速为10μl/min；
43、b2：样本加载：
44、使用注射泵将经过预处理的样本注入s1孔，进入a通道；
45、b3：分选过程：
46、在声波发生区，驻波声场对细胞施加声学辐射力；
47、分选出的ctc被引导至c通道，进入后续流程；
48、背景细胞排出并流向s6孔，供废弃或进一步分析；
49、b4：动态监控与验证：
50、在显微镜下观察分选区流体动态，确保分选效率和流速稳定；
51、收集分选样本后进行流式细胞仪检测，以评估分选纯度，目标值≥90％。
52、优选的：所述步骤c具体包括：
53、c1：系统初始化：
54、开启微流控液滴生成模块，设置流速参数：
55、e通道：10μl/min；
56、f通道：10μl/min；
57、h通道：50μl/min；
58、c2：液滴生成流程：
59、c通道：从声学分选通道直接导入分选后的ctc，无需中间收集；
60、e通道：将含有d本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种循环肿瘤细胞单细胞测序分析方法，其特征在于，基于测序分析系统实现，该系统包括：
2.根据权利要求1所述的一种循环肿瘤细胞单细胞测序分析方法，其特征在于，所述测序分析系统中：
3.根据权利要求2所述的一种循环肿瘤细胞单细胞测序分析方法，其特征在于，所述测序分析系统中，每个液滴包含一个CTC、一个DNA条形码胶球和扩增试剂；
4.根据权利要求3所述的一种循环肿瘤细胞单细胞测序分析方法，其特征在于，所述测序分析系统中，液滴内扩增与测序准备，具体如下：
5.根据权利要求1所述的一种循环肿瘤细胞单细胞测序分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的一种循环肿瘤细胞单细胞测序分析方法，其特征在于，所述步骤A具体包括：
7.根据权利要求6所述的一种循环肿瘤细胞单细胞测序分析方法，其特征在于，所述步骤B具体包括：
8.根据权利要求7所述的一种循环肿瘤细胞单细胞测序分析方法，其特征在于，所述步骤C具体包括：
9.根据权利要求8所述的一种循环肿瘤细胞单细胞测序分析方法，其特征在于
10.根据权利要求9所述的一种循环肿瘤细胞单细胞测序分析方法，其特征在于，所述步骤E具体包括：
...【技术特征摘要】
1.一种循环肿瘤细胞单细胞测序分析方法，其特征在于，基于测序分析系统实现，该系统包括：
2.根据权利要求1所述的一种循环肿瘤细胞单细胞测序分析方法，其特征在于，所述测序分析系统中：
3.根据权利要求2所述的一种循环肿瘤细胞单细胞测序分析方法，其特征在于，所述测序分析系统中，每个液滴包含一个ctc、一个dna条形码胶球和扩增试剂；
4.根据权利要求3所述的一种循环肿瘤细胞单细胞测序分析方法，其特征在于，所述测序分析系统中，液滴内扩增与测序准备，具体如下：
5.根据权利要求1所述的一种循环肿瘤细胞单细胞测序分析方...
【专利技术属性】
技术研发人员：李跟友，张伶，杜燕娥，赵浏阳，
申请(专利权)人：重庆医科大学国际体外诊断研究院，
类型：发明
国别省市：
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