【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒检测试剂，具体涉及一种牛病毒性腹泻病毒的rt-cpa检测引物和试剂盒。
技术介绍
1、牛病毒性腹泻病毒(bvdv) 是一种单股正链rna病毒，属于黄病毒科、瘟病毒属成员，能够引起牛的腹泻、发热、呼吸系统炎症、流产的一种接触性传染病。bvdv 已经呈现世界性分布， bvdv 可感染黄牛、牦牛、奶牛、山羊、绵羊、鹿、猪等多种动物。
2、牛病毒性腹泻-黏膜病（bvd-md）是由牛病毒性腹泻病毒（bvdv）引起的一种传染性疾病。该病可使患病犊牛大批死亡，患病育肥牛日渐消瘦，即使康复，也生长发育缓慢甚至成为僵牛。该病严重危害养牛业，造成了严重的经济损失。
3、目前，bvd的常规检测方法有反转录pcr、荧光实时定量pcr、elisa、间接免疫荧光、免疫胶体金等方法。反转录pcr、荧光实时定量pcr、elisa、间接免疫荧光、具备敏感性高及特异性强等优点，但对仪器和和技术人员的要求较高，操作复杂且时间较长，检测成本高，一般养殖场、基层单位难以开展。对bvd的准确检测是开展流行病学调查和防控bvd的重要手段。所以，建立操作简单、高效、灵敏的检测方法，并开发适用于现场应用的bvdv检测试剂盒显得非常重要。
4、rt-cpa扩增（逆转录交叉引发扩增）是一种核酸检测技术，它结合了逆转录和交叉引发扩增（cpa）两种方法。这种技术主要用于快速检测病毒rna，通过将rna逆转录成cdna，然后利用cpa技术进行扩增，以便于检测和分析。rt-cpa相比于普通的pcr，对引物设计的要求更为严苛，无法完全依照
技术实现思路
1、为了解决上述提到的问题，本专利技术的目的在于提供一种牛病毒性腹泻病毒的rt-cpa检测引物和试剂盒，采用本专利技术提供的检测引物和试剂盒能够准确、迅速、高灵敏地检测牛病毒性腹泻病毒。
2、为了实现上述目的，本专利技术采取下述技术方案：
3、本专利技术第一个方面公开一种用于检测牛病毒性腹泻病毒的rt-cpa检测引物，包括剥离引物，交叉引物，检测引物；
4、所述剥离引物包括e0-f和e0-r，所述e0-f的核苷酸序列如seq id no： 1所示，所述e0-r的核苷酸序列如seq id no： 2所示；
5、所述交叉引物包括e0-cpf和e0-cpr，所述e0-cpf的核苷酸序列如seq id no： 3所示，所述e0-cpr的核苷酸序列如seq id no： 4所示；
6、所述检测引物包括e0-df和e0-dr，所述e0-df的核苷酸序列如seq id no： 5所示，所述e0-dr的核苷酸序列如seq id no： 6所示。
7、其中，所述检测引物中还包括标记物，所述引物np-df的5'端加上生物素biotin，所述引物np-dr的5'端加上荧光素fitc。
8、本专利技术第二个方面公开了一种牛病毒性腹泻病毒的rt-cpa检测试剂盒，包括上述的rt-cpa检测引物。
9、优选地，所述试剂盒还包括bst ⅲ dna/rna聚合酶，dntps、reaction buffer、mgso4和betaine。本专利技术对上述试剂盒的试剂来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。本专利技术对试剂盒中试剂放置的量没有特殊限定，采用常规试剂盒中试剂放置的量即可。
10、优选地，所述试剂盒还包括核酸检测试纸条。
11、其中，所述试剂盒的使用方法为，将其中的rt-cpa检测引物在设定的扩增体系和扩增条件下进行扩增，得到扩增产物；
12、所述扩增体系每20μl中包括：reaction buffer 2.0μl，e0-cpf、e0-cpr各1.0μm，e0-f、e0-r各0.4～1.4μm，e0-df、e0-dr各0.2～1.2μm， mgso40.2～1.2mm，dntps 0.2～1.2mm，betaine 0.2～1.2mm，bst ⅲ dna/rna聚合酶0.4～1.2u，模板rna 1μl，ddh2o补足至20μl。
13、优选地，所述扩增体系每20μl中包括：reaction buffer 2.0μl，e0-cpf、e0-cpr各1.0μm，e0-f、e0-r各0.4μm，e0-df、e0-dr各0.2μm，mgso41.2mm，dntps 0.6mm，betaine0.4mm，bst ⅲ dna/rna 聚合酶1.2u，模板rna 1μl，ddh2o补足至20μl。
14、其中所述扩增条件包括：在温度为55～65℃下反应20～70min，再在温度为85℃下灭活2min。
15、优选地，所述扩增的条件包括：在温度为59℃下反应55min，再在温度为85℃下灭活2min。
16、本专利技术第三个方面公开了上述试剂盒的检测方法，当不使用核酸检测试纸条检测时，取扩增产物，用1.0％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示rt-cpa特征性梯状条带，则结果为阳性；无任何条带，则结果为阴性；
17、当使用核酸检测试纸条检测时，取扩增产物，用核酸检测试纸条检测，仅在质控区c出现一条红线，表示样品检测结果阴性；出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品检测结果阳性；在质控区c和检测区t均无红色线条出现，表明核酸检测试纸条失效，检测结果无效。
18、与现有技术相比，本专利技术有如下优势：
19、1、特异性好，能有效地检测出牛病毒性腹泻病毒；阴性对照病原如牛副流感病毒3型（bpiv3）、牛呼吸合胞病毒（brsv）均无阳性结果，同时操作简单，对仪器要求低；本专利技术利用所述的检测引物组结合反应体系优化，在核酸电泳中可以获得更清晰的产物条带，降低了检测结果受到扩增产物在反应期间发生降解的影响；
20、2、准确快速，可检测低至8.3μm的bvdv，检测时间可缩短至一小时以内；
21、3、检测结果易于判断，简单直观。（核酸检测试纸条有一条质控线和一条检测线，试纸条在质控线和检测线处都出现红线则结果为阳性。）
22、本专利技术提供的检测牛病毒性腹泻病毒的rt-cpa检测引物和试剂盒具有良好的应用前景，可适用于我国各级防控单位和各种类型的养殖场及养殖户。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种用于检测牛病毒性腹泻病毒的RT-CPA检测引物，其特征在于，包括剥离引物，交叉引物，检测引物；
2.根据权利要求1所述的一种用于检测牛病毒性腹泻病毒的RT-CPA检测引物，其特征在于，所述检测引物中还包括标记物，所述引物NP-DF的5'端加上生物素BIOTIN，所述引物NP-DR的5'端加上荧光素FITC。
3.一种牛病毒性腹泻病毒的RT-CPA检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的RT-CPA检测引物。
4.根据权利要求3所述的一种牛副流感病毒3型的RT-CPA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Bst Ⅲ DNA/RNA聚合酶，dNTPs、Reaction Buffer、MgSO4和Betaine。
5.根据权利要求3所述的一种牛副流感病毒3型的RT-CPA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸检测试纸条。
6.根据权利要求4所述的一种牛副流感病毒3型的RT-CPA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法为，将其中的RT-CPA检测引物在设定的扩增体系和扩增条件下进行扩增，得到扩
7.根据权利要求6所述的一种牛副流感病毒3型的RT-CPA检测试剂盒，其特征在于，所述扩增体系每20μL中包括：Reaction Buffer 2.0μL，E0-CPF、E0-CPR各1.0μM，E0-F、E0-R各0.4μM，E0-DF、E0-DR各0.2μM，MgSO4 1.2mM，dNTPs 0.6mM，Betaine 0.4mM，Bst Ⅲ DNA/RNA聚合酶1.2U，模板RNA 1μL，ddH2O补足至20μL。
8.根据权利要求6或7所述的一种牛副流感病毒3型的RT-CPA检测试剂盒，其特征在于，所述扩增条件包括：在温度为55～65℃下反应20～70min，再在温度为85℃下灭活2min。
9.根据权利要求8所述的一种牛副流感病毒3型的RT-CPA检测试剂盒，其特征在于，所述扩增的条件包括：在温度为59℃下反应55min，再在温度为85℃下灭活2min。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测牛病毒性腹泻病毒的rt-cpa检测引物，其特征在于，包括剥离引物，交叉引物，检测引物；
2.根据权利要求1所述的一种用于检测牛病毒性腹泻病毒的rt-cpa检测引物，其特征在于，所述检测引物中还包括标记物，所述引物np-df的5'端加上生物素biotin，所述引物np-dr的5'端加上荧光素fitc。
3.一种牛病毒性腹泻病毒的rt-cpa检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的rt-cpa检测引物。
4.根据权利要求3所述的一种牛副流感病毒3型的rt-cpa检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括bst ⅲ dna/rna聚合酶，dntps、reaction buffer、mgso4和betaine。
5.根据权利要求3所述的一种牛副流感病毒3型的rt-cpa检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸检测试纸条。
6.根据权利要求4所述的一种牛副流感病毒3型的rt-cpa检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的...
【专利技术属性】
技术研发人员：成伟伟，薛萍，李元新，孙志媛，杨明，周瑶，王佳，陈伯祥，赵子惠，唐芸娇，吕亚伟，
申请(专利权)人：甘肃省畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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