【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及属于合成生物学领域。更具体地，本专利技术在例如盐单胞菌halomonasbluephagenesis中构建了从δ-戊内酯(δ-valerolactone)合成聚戊内酯的非天然代谢通路，实现了聚戊内酯在盐单胞菌h.bluephagenesis中的生物合成。
技术介绍
1、halomonas bluephagenesis是一种耐高温和高ph的嗜盐微生物，拥有天然合成聚羟基脂肪酸(聚3-羟基丁酸)(phb)的能力，是下一代工业生物技术的优良菌株。其开放式连续发酵的特点拥有节约能源，降低成本等不可替代的优点，具有独特的发酵优势和市场竞争力。目前对于嗜盐菌株的基因组注释和基因编辑方法已经较为成熟，因此具备开发丰富产物的潜能。
2、聚戊内酯(pvl)是一种聚羟基脂肪酸均聚物，由于其生物降解性、生物相容性和渗透性，pvl和基于pvl的共聚物被报道用于药物递送载体、细胞培养基质、食品和药物包装和涂料等，在食品、药品和工业应用中具有很大的应用潜能。
3、首先，h.bluephagenesis天然合成phb依赖于内源β-酮硫解酶(phaa)，乙酰乙酰辅酶a还原酶(phab)和聚羟基脂肪酸聚合酶(phac)，但不具备合成pvl的能力。其次，由于其天然合成phb的优良能力，对于3-羟基丁酸(3hb)单体的聚合能力很强，因此目前h.bluephagenesis中合成的聚羟基脂肪酸酯(pha)几乎均含有较高比例的3hb单体。
4、由于酶对催化底物严格的特异性和催化活性，筛选得到在h.bluephagenes
5、由于h.bluephagenesis天然拥有很强的合成phb的能力，且已知的phac都可以识别和聚合3-羟基丁酰辅酶a。因此，对于细菌内源由葡萄糖为原料进行糖酵解得到乙酰辅酶a，从而进一步合成phb的通路需要被抑制。
6、此外，即使阻断了合成phb的通路，依然存在其他来源的3-羟基丁酰辅酶a(3hb-coa)。为进一步提高5hv单体在聚合物中的比例，对细菌中除糖酵解外其他来源的3hb-coa通路的相关基因进行敲除。
7、当前，pvl主要通过基于开环聚合的化学反应合成。开环聚合以δ-戊内酯为原料，利用阳离子催化剂，在有机溶剂中于高温条件下反应生成聚戊内酯。也有研究报道由闪烁古生球菌(archaeoglobusfulgidus)的嗜热酯酶可以在70℃的甲苯中催化δ-戊内酯开环聚合反应，反应72小时得到聚戊内酯。最近有研究发表在大肠杆菌中从构建非天然代谢通路实现由α-酮戊二酸到pvl的生产。
8、通过开环聚合的化学反应得到的pvl，由于延展性差(εb<30％)、分子量低(<5kda)以及金属催化剂和有机溶剂污染，其力学性能仍不足以用于包装或医药。利用古生菌中的嗜热酯酶生产pvl，需要纯化得到具有活性的酯酶，过程繁琐，温度和反应条件需要严格控制，得到的材料也存在有机试剂污染且分子量很低(<2kda)。在大肠杆菌中构建代谢通路生产的聚戊内酯产量较低(<412mg/l)，且占细胞干重百分比较低(20.5％)，因此不能应用于工业生产。同时，在大肠杆菌中合成的pvl材料未经nmr确定，可能含有细胞中其他羟基脂肪酸单体如3-羟基丁酸的污染。且其材料力学性能未被表征。
9、综上，目前存在的pvl合成方法得到的pvl都存在分子量较低，存在污染，且不适合大规模工业生产的缺点。
10、有鉴于此，目前需要开发一种在h.bluephagenesis中生成pvl的非天然代谢通路，以实现pvl的大规模生物合成。
技术实现思路
1、本专利技术人为了解决现有技术问题，对聚羟基脂肪酸聚合酶和4-羟基丁酰辅酶a转移酶进行筛选，将原本不能合成聚戊内酯的宿主菌如嗜盐菌，经过改造实现了聚戊内酯的生物合成，开发了由戊内酯单体为底物的聚戊内酯生产菌，对于工业上用生物方法生产聚戊内酯具有深远意义。
2、因此，本专利技术一方面提供了一种生产聚戊内酯(pvl)的工程菌，其表达或过表达外源或内源聚羟基脂肪酸聚合酶(例如phacun)和5-羟基丁酸单体的辅酶a连接酶(例如4-羟基丁酰辅酶a转移酶，abft)，优选所述工程菌不具有或者已经被敲除或敲低了内源β-酮硫解酶(phaa)基因、乙酰乙酰辅酶a还原酶(phab)基因、pha聚合酶(phac)基因和烯酯酰辅酶a水合酶(fadb)基因中的一种或多种(优选全部)。聚羟基脂肪酸聚合酶(phac)可以例如选自phacun、phacre、phac4ak4、phac61-3、phac1437、phacac和phacar，和/或-羟基丁酸单体的辅酶a连接酶可以例如选自4-羟基丁酰辅酶a转移酶(abft)、orfz、pct540和alkk。
3、在一个具体实施方式中，所述工程菌不能或者几乎不能生产聚3-羟基丁酸(phb)，例如在以葡萄糖为碳源的矿物培养基中。“几乎不能生产聚3-羟基丁酸(phb)”是指phb在发酵培养后的细胞干重含量(wt％)低于5％、4％、3％、2％、甚至1％。
4、在一个具体实施方式中，其中所述工程菌选自嗜盐菌，优选选自盐单胞菌属(halomonas)、假单胞菌属(pseudomonas)、大肠杆菌属(escherishia)、罗氏真养杆菌(ralstonia eutropha)、气生单胞菌属(aeromonas)、芽孢杆菌属(bacilllus)、巨大产碱杆菌(alcaligenes latus)、富养产碱菌(alcaligenes eutropus)或它们的组合，更优选为盐单胞菌(halomonas)，还更优选为halomonas bluephagenesis、halomonasaydingkolgenesis、halomonas campaniensis或halomonas lutescens，最优选为halomonas bluephagenesis td01(菌种保藏编号cgmcc no.4353)、halomonasbluephagenesis td141、halomonas bluephagenesis td1.0、halomonasaydingkolgenesis m1(菌种保藏编号cgmcc no.19880)或halomonas campaniensis ls21(菌种保藏编号cgmcc no.6593)。
5、在一个具体实施方式中，所述聚羟基脂肪酸聚合酶(phacun)和5-羟基丁酸单体的辅酶a连接酶(4-羟基丁酰辅酶a转移酶，abft)是各自独立地在工程菌的基因组上或者在一个或多个质粒上表达或过表达的。
6、在一个具体实施方式中，所述4-羟基丁酰辅酶a转移酶的编码基因abft来源于氨基丁酸梭菌(clostridium aminobutyricum)，和/或所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产聚戊内酯(PVL)的工程菌，其表达或过表达外源或内源聚羟基脂肪酸聚合酶和5-羟基丁酸单体的辅酶A连接酶，优选所述工程菌不具有或者已经被敲除或敲低了内源β-酮硫解酶(PhaA)基因、乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhaB)基因、PHA聚合酶(PhaC)基因和烯酯酰辅酶A水合酶(FadB)基因中的一种或多种(优选全部)。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其不能或者几乎不能生产聚3-羟基丁酸(PHB)，例如在以葡萄糖为碳源的矿物培养基中。
3.根据权利要求1或2所述的工程菌，其中所述工程菌选自嗜盐菌，优选选自盐单胞菌属(Halomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、大肠杆菌属(Escherishia)、罗氏真养杆菌(Ralstonia eutropha)、气生单胞菌属(Aeromonas)、芽孢杆菌属(Bacilllus)、巨大产碱杆菌(Alcaligenes latus)、富养产碱菌(Alcaligenes eutropus)或它们的组合，更优选为盐单胞菌(Halomonas)，还更优选为Halomonas bluephagenesis、Ha
4.根据权利要求1至3中任一项所述的工程菌，其中所述聚羟基脂肪酸聚合酶选自PhaCun、PhaCre、PhaC4AK4、PhaC61-3、PhaC1437、PhaCac和PhaCar，和/或所述5-羟基丁酸单体的辅酶A连接酶选自4-羟基丁酰辅酶A转移酶(AbfT)、orfZ、pct540和alkK，优选所述聚羟基脂肪酸聚合酶为PhaCun并且所述5-羟基丁酸单体的辅酶A连接酶为4-羟基丁酰辅酶A转移酶(AbfT)，更优选地所述聚羟基脂肪酸聚合酶(PhaCun)和5-羟基丁酸单体的辅酶A连接酶(4-羟基丁酰辅酶A转移酶，AbfT)是各自独立地在所述工程菌的基因组上或者在一个或多个质粒上表达或过表达的。
5.根据权利要求4所述的工程菌，其中所述4-羟基丁酰辅酶A转移酶的编码基因abfT来源于氨基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)，和/或所述聚羟基脂肪酸聚合酶的编码基因phaCun来源于红森林沼泽地非实验室可培养的菌株(uncultured bacteria)或者是该基因的突变体，优选地所述聚羟基脂肪酸聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，更优选所述phaCun的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，和/或优选地所述4-羟基丁酰辅酶A转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，更优选所述abfT的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的工程菌，其中所述聚羟基脂肪酸聚合酶(PhaCun)的编码基因和4-羟基丁酰辅酶A转移酶(AbfT)的编码基因各自独立地在组成型或诱导型启动子的控制下表达，优选所述诱导型启动子选自IPTG诱导型Mmp1启动子、lux启动子、lac启动子、trp启动子、tac启动子或它们的组合，优选所述组成型启动子选自野生型Pporin启动子或其突变体，其中所述突变体选自porin3、porin42、porin58、porin68、porin140、porin141、porin194、porin211、porin221、porin226、porin278、或它们的组合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的工程菌，其中通过转化或接合将所述聚羟基脂肪酸聚合酶(PhaCun)的编码基因和4-羟基丁酰辅酶A转移酶(AbfT)的编码基因导入所述工程菌中。
8.一种生产聚戊内酯(PVL)的方法，所述方法包括发酵培养根据权利要求1至7中任一项所述的工程菌。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述发酵培养是：A)采用矿物培养基，B)以戊内酯为底物，和/或C)在开放条件下进行。
10.一种聚戊内酯，其中：
...【技术特征摘要】
1.一种生产聚戊内酯(pvl)的工程菌，其表达或过表达外源或内源聚羟基脂肪酸聚合酶和5-羟基丁酸单体的辅酶a连接酶，优选所述工程菌不具有或者已经被敲除或敲低了内源β-酮硫解酶(phaa)基因、乙酰乙酰辅酶a还原酶(phab)基因、pha聚合酶(phac)基因和烯酯酰辅酶a水合酶(fadb)基因中的一种或多种(优选全部)。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其不能或者几乎不能生产聚3-羟基丁酸(phb)，例如在以葡萄糖为碳源的矿物培养基中。
3.根据权利要求1或2所述的工程菌，其中所述工程菌选自嗜盐菌，优选选自盐单胞菌属(halomonas)、假单胞菌属(pseudomonas)、大肠杆菌属(escherishia)、罗氏真养杆菌(ralstonia eutropha)、气生单胞菌属(aeromonas)、芽孢杆菌属(bacilllus)、巨大产碱杆菌(alcaligenes latus)、富养产碱菌(alcaligenes eutropus)或它们的组合，更优选为盐单胞菌(halomonas)，还更优选为halomonas bluephagenesis、halomonasaydingkolgenesis、halomonas campaniensis或halomonaslutescens，最优选为halomonasbluephagenesis td01(菌种保藏编号cgmcc no.4353)、halomonas bluephagenesistd141、halomonas bluephagenesis td1.0、halomonas aydingkolgenesis m1(菌种保藏编号cgmcc no.19880)或halomonas campaniensis ls21(菌种保藏编号cgmcc no.6593)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的工程菌，其中所述聚羟基脂肪酸聚合酶选自phacun、phacre、phac4ak4、phac61-3、phac1437、phacac和phacar，和/或所述5-羟基丁酸单体的辅酶a连接酶选自4-羟基丁酰辅酶a转移酶(abft)、orfz、pct540和alkk，优选所述聚羟基脂肪酸聚合酶为phacun并且所述5-羟基丁...
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