【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术技术涉及检测病原性感染的宿主特征的系统、方法和组合物，并且具体地涉及被配置成检测可能是感染的生物标志物的靶rna转录物的快速检测测定。
技术介绍
1、病原性微生物感染的早期检测对于适当的治疗和积极的临床结果至关重要。然而，受感染个体可能在感染后几天保持无症状，同时积极地将病原体传播给其它人。传统的病原体检测系统通常不能有效地检测感染，直到症状发作之后。传统的病原体测试包含血清学或基于抗体的测试、细菌/病毒/真菌生长培养和基于核酸的检测，如pcr(聚合酶链式反应)。此类传统测试通常是费时费力的，并且仅在患者开始表现出感染症状之后才有效。另外，传统的诊断测试需要对特定病原体进行临床怀疑、昂贵的实验室设备和受过训练的人员，并且具有增加的上游和最终用户成本。
2、例如，如图2中突出显示的，在典型的感染过程中，暴露于未知病原体发生在第零天并且然后进展通过随后的临床感染阶段，如沿着图的左侧竖直延伸的时间线所指示的。在病原体在受感染的人体内复制时，标准的诊断测试通常被设计成在症状发作之后工作，此时人们知道有什么错误并且寻求医疗保健和诊断。然而，此时所述受感染的人可能已经传染给其它人数天或数周。实施早期隔离并限制病原体无阻碍传播的破坏性下游效应的机会已经错过。在患者知道自己具有传染性之前，这种对诊断的时间延迟可能导致不良的患者结果和持续的疾病传播。
3、与专门的并且后来发展适应性免疫应答相反，宿主抵御病原性微生物的第一道防线是“先天免疫”应答。身体的先天免疫是发生在感染数小时内的自我扩增和非特异性生理应答。如此
4、全球冠状病毒疫情已经放大了对检测病原体的改进方法的需求，尤其是在感染周期的早期。冠状病毒(冠状病毒科和冠状病毒亚科的成员)发现于哺乳动物和鸟类中。一个突出的成员是严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)。另一种突出的冠状病毒(被称为中东呼吸综合征冠状病毒(mers冠状病毒或mers-cov)mers-cov)与sars-cov爆发有一些相似性。sars、mers和covid-19冠状病毒感染的典型症状包含发烧、咳嗽、呼吸短促、肺炎和胃肠道症状。严重的疾病可能导致需要在重症监护病房进行机械通气和支持的呼吸衰竭。两种冠状病毒似乎在老年人、免疫系统薄弱的人和患有如癌症、慢性肺病和糖尿病等慢性病的人中引起更严重的疾病。目前没有疫苗或特异性治疗可用于covid-19。诊断患有covid-19冠状病毒感染的患者仅接受基于个体的症状和临床病状的支持性治疗。
5、如下文所述，诸位专利技术人已经克服传统病原体检测系统的限制，同时利用宿主的早期先天免疫应答(包含但不限于干扰素应答)来快速检测指示感染，并且特别是covid-19冠状病毒感染的rna生物标志物。当患者通常无症状时，这种快速的护理点诊断应用允许在早期阶段检测感染。这种早期检测与更靶向且有效的治疗干预以及整体改善的临床结果直接相关。
技术实现思路
1、本专利技术技术可以包含用于通过新型侧流测定早期检测无症状受试者的病原体和/或感染的系统、方法和组合物，在优选实施例中，所述新型侧流测定可以包含快速测试条，所述快速测试条被配置成检测由受试者的先天免疫系统响应于病原体或感染而产生并存在于唾液中的一种或多种rna转录物生物标志物。
2、在另一方面，本专利技术技术可以包含用于通过新型侧流测定早期检测无症状受试者的病原体和/或感染的系统、方法和组合物，在优选实施例中，所述新型侧流测定可以包含快速测试条，所述快速测试条被配置成检测由受试者的先天免疫系统响应于病原体或感染而产生并可能存在于唾液中的根据seq id no.1-444和657-815的核苷酸序列中的一个或多个核苷酸序列编码的一种或多种rna转录物生物标志物。
3、本专利技术的另外的方面包含根据seq id no.1-444和657-815中鉴定的核苷酸序列，一种或多种生物标志物用于人的感染，并且优选地病原体感染的用途。
4、在另一方面，本专利技术技术可以包含用于检测这些靶rna转录物的系统、方法和组合物，所述靶rna转录物可以充当受试者的早期感染的生物标志物。
5、在另一方面，本专利技术技术可以包含用于检测受试者的早期感染的系统、方法和组合物，所述系统、方法和组合物可以包含至少：侧流测定测试条装置，所述侧流测定测试条装置可以优选地包含被配置成允许液体通过毛细作用流动的基于纤维或纸的侧流条；2)rt-rpa(逆转录重组酶聚合酶扩增)反应，所述反应可以发生在预制备的反应筒中，所述反应筒可以包含被配置成从受试者接收流体样品并且预制备以进行rt-rpa反应的集合容器；以及3)在流体样品中供应的通常也被称为生物标志物的一种或多种rna生物标志物转录物，例如由鉴定为seq id no.1-444和657-815的核苷酸序列编码的一种或多种生物标志物，所述流体样品在优选实施例可以包含由受试者提供的唾液样品。在优选实施例中，rna生物标志物转录物可以在等温扩增rt-rpa反应中在反应筒中扩增，以形成具有单链衔接子序列的杂交dsdna探针或含有用于下游杂交的5'修饰的dsdna产物。
6、另外的方面可以包含可以与杂交dsdna探针偶联的新型缀合的报告探针。在某些方面，新型缀合的探针可以包含gnp，或与可以与dsdna探针结合的ssdna序列或抗体或抗体片段缀合的其它单个报告基因。而本专利技术的另外的方面可以包含新型靶捕获探针，所述靶捕获探针可以结合并形成固定化“夹心”复合物聚集体，所述复合物聚集体包括与杂交dsdna探针偶联的嵌入式捕获探针，所述杂交dsdna探针进一步与缀合的报告探针并且优选地gnp报告探针偶联。在此方面，局部固定可以促进例如在测试条或甚至溶液上产生视觉信号。
7、本专利技术的另外的方面包含用于对早期宿主源性感染生物标志物进行定量的系统、方法和组合物，所述生物标志物可以与或可以不与针对优选地通过pcr、rt-pcr或qrt-pcr产生的病原体特异性生物标志物的定量数据组合。在一个优选的方面，rna可以从潜在暴露或由感染的受试者提供的生物样品中提取。rna可以进行qrt-pct反应，以确定病原体生物标志物以及宿主源性感染生物标志物，并且优选地存在于受试者的唾液中的宿主源性rna生物标志物的水平。可以从一个或多个受试者获取多个生物样品，以产生显示病原体和宿主源性生物标志物随时间推移的相对水平的感染时程。此数据可以用于产生用于侧流测定的生物标志物候选物，以检测病原体特异性宿主源性生物标志物。此侧流测定可以施用于有需要的受试者，并且提供感染的指示以及一种或多种特定病原体的感染阶段。在一个优选的方面，特定病原体可以包含sars-cov-2，通常被称为covid-19冠状病毒。
8、本专利技术的另外的方面可以包含权利要求中阐述的一个或多个优选实施例。
9、本专利技术的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测宿主RNA转录物生物标志物的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述体液样品包括唾液样品。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述转化步骤包括通过等温逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)反应将所述RNA转录物生物标志物转化成DNA探针的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其中将产生等温逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)反应所必需的试剂预装载到反应筒中。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述dsDNA靶序列通过连接子与所述ssDNA退火区和所述ssDNA靶捕获区偶联。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述连接子包括三碳链间隔子(C3)连接子。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA缀合的报告探针包括缀合的金纳米颗粒(GNP)探针。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述缀合的(GNP)探针包括通过硫醇、PEG18和PolyA构建体与所述ssDNA退火区偶联的GNP。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶捕获探针包括具有与生物素
10.根据权利要求1和8中任一项所述的方法，其中所述侧流测定测试条进一步包括：
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述膜包括硝酸纤维素膜。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述RNA转录物生物标志物包括至少一种RNA转录物生物标志物，所述至少一种RNA转录物生物标志物由至少一个选自由以下组成的组的核苷酸序列编码：SEQ ID NO.1-444和657-815。
13.一种用于早期检测RNA转录物生物标志物的侧流测定，所述侧流测定包括：
14.根据权利要求13所述的侧流测定，其中所述体液样品包括唾液样品。
15.根据权利要求13所述的侧流测定，其中将产生所述等温RT-RPA反应所必需的试剂预装载到所述反应筒中。
16.根据权利要求13所述的侧流测定，其中所述膜包括硝酸纤维素膜。
17.根据权利要求13所述的侧流测定，其中所述杂交dsDNA探针包括：
18.根据权利要求17所述的侧流测定，其中杂交dsDNA探针上的所述ssDNA退火区与所述DNA缀合的报告探针的ssDNA退火区互补，使得两个探针在所述经扩增溶液中偶联在一起。
19.根据权利要求18所述的侧流测定，其中所述dsDNA靶序列通过连接子与所述ssDNA退火区和所述ssDNA靶捕获区偶联。
20.根据权利要求19所述的侧流测定，其中所述连接子包括三碳链间隔子(C3)连接子。
21.根据权利要求13所述的侧流测定，其中所述DNA缀合的报告探针包括缀合的金纳米颗粒(GNP)探针。
22.根据权利要求21所述的侧流测定，其中所述缀合的GNP探针包括通过硫醇、PEG18和PolyA构建体与所述ssDNA退火区偶联的GNP。
23.根据权利要求13和17中任一项所述的侧流测定，其中所述靶捕获探针包括具有与生物素-TEG连接子偶联的固定化链霉亲和素碱基四聚体的靶捕获探针，所述生物素-TEG连接子可进一步与所述ssDNA靶捕获探针序列偶联，所述ssDNA靶捕获探针序列与所述杂交dsDNA探针上的所述靶捕获区互补。
24.根据权利要求13所述的侧流测定，其中所述宿主RNA转录物生物标志物包括至少一种RNA转录物生物标志物，所述至少一种RNA转录物生物标志物由至少一个选自由以下组成的组的核苷酸序列编码：SEQ ID NO.1-444和657-815。
25.一种用于早期检测RNA转录物生物标志物的基于抗体的侧流测定，所述侧流测定包括：
26.根据权利要求25所述的基于抗体的侧流测定，其中所述体液样品包括唾液样品。
27.根据权利要求25所述的基于抗体的侧流测定，其中将产生所述等温RT-RPA反应所必需的试剂预装载到所述反应筒中。
28.根据权利要求25所述的基于抗体的侧流测定，其中所述膜包括硝酸纤维素膜。
29.根据权利要求25所述的基于抗体的侧流测定，其中所述杂交dsDNA探针包括：
30.根据权利要求29所述的基于抗体的侧流测定，其中所述5′正向ssDNA寡核苷酸包括5′FITC正向寡核苷酸。
31.根据权利要求25所述的基于抗体的侧流测定，...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种检测宿主rna转录物生物标志物的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述体液样品包括唾液样品。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述转化步骤包括通过等温逆转录重组酶聚合酶扩增(rt-rpa)反应将所述rna转录物生物标志物转化成dna探针的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其中将产生等温逆转录重组酶聚合酶扩增(rt-rpa)反应所必需的试剂预装载到反应筒中。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述dsdna靶序列通过连接子与所述ssdna退火区和所述ssdna靶捕获区偶联。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述连接子包括三碳链间隔子(c3)连接子。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述dna缀合的报告探针包括缀合的金纳米颗粒(gnp)探针。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述缀合的(gnp)探针包括通过硫醇、peg18和polya构建体与所述ssdna退火区偶联的gnp。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶捕获探针包括具有与生物素-teg连接子偶联的固定化链霉亲和素碱基四聚体的靶捕获探针，所述生物素-teg连接子可进一步与所述ssdna靶捕获探针序列偶联，所述ssdna靶捕获探针序列与所述杂交链霉亲和素上的所述靶捕获区互补。
10.根据权利要求1和8中任一项所述的方法，其中所述侧流测定测试条进一步包括：
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述膜包括硝酸纤维素膜。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述rna转录物生物标志物包括至少一种rna转录物生物标志物，所述至少一种rna转录物生物标志物由至少一个选自由以下组成的组的核苷酸序列编码：seq id no.1-444和657-815。
13.一种用于早期检测rna转录物生物标志物的侧流测定，所述侧流测定包括：
14.根据权利要求13所述的侧流测定，其中所述体液样品包括唾液样品。
15.根据权利要求13所述的侧流测定，其中将产生所述等温rt-rpa反应所必需的试剂预装载到所述反应筒中。
16.根据权利要求13所述的侧流测定，其中所述膜包括硝酸纤维素膜。
17.根据权利要求13所述的侧流测定，其中所述杂交dsdna探针包括：
18.根据权利要求17所述的侧流测定，其中杂交dsdna探针上的所述ssdna退火区与所述dna缀合的报告探针的ssdna退火区互补，使得两个探针在所述经扩增溶液中偶联在一起。
19.根据权利要求18所述的侧流测定，其中所述dsdna靶序列通过连接子与所述ssdna退火区和所述ssdna靶捕获区偶联。
20.根据权利要求19所述的侧流测定，其中所述连接子包括三碳链间隔子(c3)连接子。
21.根据权利要求13所述的侧流测定，其中所述dna缀合的报告探针包括缀合的金纳米颗粒(gnp)探针。
22.根据权利要求21所述的侧流测定，其中所述缀合的gnp探针包括通过硫醇、peg18和polya构建体与所述ssdna退火区偶联的gnp。
23.根据权利要求13和17中任一项所述的侧流测定，其中所述靶捕获探针包括具有与生物素-teg连接子偶联的固定化链霉亲和素碱基四聚体的靶捕获探针，所述生物素-teg连接子可进一步与所述ssdna靶捕获探针序列偶联，所述ssdna靶捕获探针序列与所述杂交dsdna探针上的所述靶捕获区互补。
24.根据权利要求13所述的侧流测定，其中所述宿主rna转录物生物标志物包括至少一种rna转录物生物标志物，所述至少一种rna转录物生物标志物由至少一个选自由以下组成的组的核苷酸序列编码：seq id no.1-444和657-815。
25.一种用于早期检测rna转录物生物标志物的基于抗体的侧流测定，所述侧流测定包括：
26.根据权利要求25所述的基于抗体的侧流测定，其中所述体液样品包括唾液样品。
27.根据权利要求25所述的基于抗体的侧流测定，其中将产生所述等温rt-rpa反应所必需的试剂预装载到所述反应筒中。
28.根据权利要求25所述的基于抗体的侧流测定，其中所述膜包括硝酸纤维素膜。
29.根据权利要求25所述的基于抗体的侧流测定，其中所述杂交dsdna探针包括：
30.根据权利要求29所述的基于抗体的侧流测定，其中所述5′正向ssdna寡核苷酸包括5′fitc正向寡核苷酸。
31.根据权利要求25所述的基于抗体的侧流测定，其中所述5′反向ssdna寡核苷酸包括5′dig反向寡核苷酸或5′生物素反向寡核苷酸。
32.根据权利要求30所述的基于抗体的侧流测定，其中所述缀合的报告探针包括与形成抗体缀合的报告探针的抗体偶联的金纳米颗粒(gnp)。
33.根据权利要求32所述的基于抗体的侧流测定，其中所述抗体包括抗fitc抗体。
34.根据权利要求30和33所述的基于抗体的侧流测定，其中所述fitc抗体与所述杂交dsdna探针的所述5′fitc正向寡核苷酸结合。
35.根据权利要求25所述的基于抗体的侧流测定，其中所述检测区的所述靶捕获探针包括抗dig抗体。
36.根据权利要求31和35所述的基于抗体的侧流测定，其中所述抗dig抗体与所述杂交dsdna探针的所述5′dig反向寡核苷酸结合。
37.根据权利要求25和31所述的基于抗体的侧流测定，其中所述对照区的所述靶捕获探针包括具有与生物素-teg连接子偶联的固定化链霉亲和素碱基四聚体的靶捕获探针，所述生物素-teg连接子可进一步与所述5′生物素反向寡核苷酸偶联。
38.根据权利要求30所述的基于抗体的侧流测定，其中所述检测区的所述靶捕获探针包括抗兔抗体。
39.根据权利要求25所述的基于抗体的侧流测定，其中所述宿主rna转录物生物标志物包括至少一种rna转录物生物标志物，所述至少一种rna转录物生物标志物由至少一个选自由以下组成的组的核苷酸序列编码：seq id no.1-444和657-815。
40.一种早期病原体检测的方法，所述方法包括以下步骤：
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述体液样品包括唾液样品。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述宿主源性感染生物标志物包括宿主源性感染rna生物标志物。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述病原体生物标志物包括选自由以下组成的组的病原体生物标志物：病毒病原体生物标志物、细菌病原体生物标志物和病原体真菌生物标志物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述病毒病原体生物标志物包括来自新型冠状病毒sars-cov-2的病毒病原体生物标志物。
45.根据权利要求40所述的方法，其中所述来自新型冠状病毒sars-cov-2的病毒病原体生物标志物包括一种或多种可在pcr反应中通过根据seq id no.469-480的核苷酸引物扩增的生物标志物。
46.根据权利要求40所述的方法，其中所述宿主源性感染生物标志物包括宿主源性感染rna生物标志物，并且所述方法进一步包括通过等温逆转录重组酶聚合酶扩增(rt-rpa)反应将所述宿主源性感染rna生物标志物转化成杂交双链dna(dsdna)探针的步骤。
47.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测步骤包括根据权利要求1到12所述的方法。
48.一种检测有需要的受试者的感染的方法，所述方法包括从由所述受试者提供的生物样品中检测至少一种宿主源性感染rna生物标志物的步骤，其中所述至少一种宿主源性感染rna生物标志物选自由以下组成的组...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·L·索耶，N·R·迈耶森，C·L·佩奇，杨青，R·道尔，
申请(专利权)人：科罗拉多大学董事会，法人团体，
类型：发明
国别省市：
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