【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、在低聚糖群中，人乳低聚糖(hmo)因其健康有益作用，近年来引起了广泛关注。例如，hmo可以阻止病原微生物附着在胃肠道粘膜细胞上，从而预防疾病的出现。此外，hmo还发挥益生元作用，即促进非致病性肠道细菌的增殖。还描述了对成熟的免疫系统和神经系统的有益作用。
2、由于hmo的有益作用，它们的工业生产也备受关注。经济上最可行的hmo制造似乎是通过基因工程化微生物细胞(诸如大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、谷氨酸棒状杆菌细胞或酿酒酵母细胞)进行发酵生产。
3、一般来说，工业规模的生物过程(诸如由微生物细胞/在微生物细胞中发酵生产低聚糖)涉及生产阶段，在此阶段发生目的低聚糖的生物合成。生产阶段之后是产物回收阶段，其中从培养液和/或微生物细胞回收目的低聚糖。已知葡萄糖、蔗糖或甘油等不同底物可作为生产阶段中微生物细胞的碳源和能量源。
4、甘油是微生物细胞的碳源，最近对于发酵生产过程变得具有经济吸引力。由于甘油是生物柴油生产的副产物，因此随着作为汽油基燃料替代品的生物柴油的产量增加，市场上甘油供应也随之增加。
5、一种在低聚糖(尤其是人乳低聚糖)发酵生产中特别受关注的微生物细胞是革兰氏阴性细菌大肠杆菌。大肠杆菌是一种能够代谢甘油作为碳源和能量源的微生物。大肠杆菌中的分解代谢可以在有氧或无氧条件下进行。大肠杆菌中甘油的分解代谢途径如图1所示。主要有氧途径涉及通过甘油吸收促进剂“glpf”(由glpf基因编码)、甘油激酶(由glpk基因编码)和甘油-3-磷酸脱氢酶(由glpd基因编码)进
6、由于glda基因在大肠杆菌基因组中的位置，即靠近编码多磷酰基转运蛋白2的ptsa基因和编码果糖-6-磷酸醛缩酶的fsab，并且由于甘油脱氢酶glda对二羟基丙酮的亲和力高于对甘油的亲和力，因此有人建议glda的主要作用是将二羟基丙酮转化为甘油，以防止大肠杆菌细胞受到二羟基丙酮的毒性。此外，二羟基丙酮还可以自发地转化为甲基乙二醛，这是大肠杆菌的一种剧毒代谢物，浓度低至0.3mm即可抑制大肠杆菌的生长。
7、因此，当存在甘油作为碳源和能量源的情况下培养微生物细胞时，希望使用于生产目的低聚糖的微生物细胞不易受到来自甘油分解代谢途径的代谢物毒性的影响。
技术实现思路
1、令人惊奇地发现，当能够在细胞内合成人乳低聚糖的大肠杆菌细胞拥有其甘油激酶的某些变体时，它们能够提高人乳低聚糖的产量，并且不受甲基乙二醛毒性的影响。
2、因此，在第一方面，提供了一种用于生产目的低聚糖的基因工程化微生物细胞，其中该基因工程化微生物细胞在存在甘油作为唯一碳源的情况下培养时能够细胞内合成目的低聚糖。所述微生物细胞具有甘油通透酶(也称为甘油吸收促进剂)，用于内化外源甘油。所述微生物细胞进一步具有原生大肠杆菌甘油激酶glpk的功能变体，其中所述原生大肠杆菌glpk的氨基酸序列如seq id no:1所示，其中所述功能变体在其氨基酸序列中对应于原生大肠杆菌glpk氨基酸序列中氨基酸位置55的位置处具有包含非离子化但极性的作用侧链的氨基酸残基，和/或其中所述功能变体在其氨基酸序列中对应于原生大肠杆菌glpk氨基酸序列中氨基酸位置231的位置处具有包含阴离子侧链的氨基酸。所述基因工程化微生物细胞进一步具有用于细胞内生物合成核苷酸活化的单糖的代谢途径，该核苷酸活化的单糖包含核苷酸部分和单糖部分，其中所述核苷酸活化的单糖是用于将其单糖部分转移至受体分子的供体底物。所述基因工程化微生物细胞进一步具有糖基转移酶，用于将单糖部分从核苷酸活化的单糖转移到受体分子，以进行目的低聚糖的细胞内生物合成。
3、在第二方面，提供了根据第一方面的基因工程化微生物细胞用于生产目的低聚糖的用途。因此，该用途包括基因工程化微生物细胞的用途，其中该基因工程化微生物细胞在存在甘油作为唯一碳源的情况下培养时能够细胞内合成目的低聚糖，其中该基因工程化微生物细胞在存在甘油作为唯一碳源的情况下培养时能够细胞内合成目的低聚糖。所述微生物细胞具有甘油通透酶(也称为甘油吸收促进剂)，以内化外源甘油。所述微生物细胞进一步具有原生大肠杆菌甘油激酶glpk的功能变体，其中原生大肠杆菌glpk的氨基酸序列如seq id no:1所示，其中所述功能变体在其氨基酸序列中对应于原生大肠杆菌glpk的氨基酸序列中氨基酸位置55的位置处具有包含非离子化但极性的作用侧链的氨基酸残基，和/或其中所述功能变体在其氨基酸序列中对应于原生大肠杆菌glpk的氨基酸序列中氨基酸位置231的位置处具有包含阴离子侧链的氨基酸。所述基因工程化微生物细胞进一步包含用于细胞内生物合成核苷酸活化的单糖作为单糖部分的供体底物的代谢途径，并且所述基因工程化微生物细胞进一步包含用于将单糖部分从核苷酸活化的单糖转移到受体分子的糖基转移酶。
4、在第三方面，提供了一种用于发酵生产目的低聚糖的方法，其中该方法包括：
5、-提供根据第一方面的用于生产目的低聚糖的基因工程化微生物细胞，即，当在存在甘油作为唯一碳源的情况下培养时，能够细胞内合成目的低聚糖的基因工程化微生物细胞，其中所述基因工程化细菌包含甘油通透酶和原生大肠杆菌甘油激酶glpk的功能变体、用于细胞内生物合成核苷酸活化的单糖作为其单糖部分的供体底物的代谢途径以及用于将单糖部分从核苷酸活化的单糖转移到受体分子的糖基转移酶，其中所述原生大肠杆菌glpk的氨基酸序列如seq id no:1所示，其中所述功能变体在其氨基酸序列中对应于原生大肠杆菌glpk的氨基酸序列中氨基酸位置55的位置处具有包含非离子化但极性的作用侧链的氨基酸残基，和/或其中所述功能变体在其氨基酸序列中对应于原生大肠杆菌glpk的氨基酸序列中氨基酸位置231的位置处具有包含阴离子侧链的氨基酸；
6、-在培养基中和在允许基因工程化微生物细胞在细胞内合成目的低聚糖的条件下培养所述基因工程微生物细胞，其中所述培养基含有甘油作为所述基因工程化微生物细胞的碳源；以及
7、-可选地，从微生物细胞和/或培养基中回收目的低聚糖。
8、在进一步方面，提供了一种用于当在存在甘油作为碳源的情况下培养微生物细胞时减轻甲基乙二醛对微生物细胞的毒性的方法，该方法包括转化微生物细胞以具有原生大肠杆菌甘油激酶glpk的功能变体，其中所述原生大肠杆菌glpk的氨基酸序列如seq id no:1所示，其中所述功能变体在其氨基酸序列中对应于原生大肠杆菌glpk的氨基酸序列中氨基酸位置55的位置处具有包含非离子本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于细胞内生物合成目的低聚糖的基因工程化微生物细胞，其中，在存在甘油作为唯一碳源和能量源的情况下培养时，所述基因工程化微生物细胞在细胞内合成目的低聚糖，其中，所述基因工程化微生物细胞包含：
2.根据权利要求1所述的基因工程化微生物细胞，其中，具有非离子化但极性的作用侧链的所述氨基酸残基选自L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-蛋氨酸、L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程化细菌细胞，其中，所述阴离子氨基酸残基选自L-天冬氨酸和L-谷氨酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的基因工程化微生物细胞，其中，所述功能变体与大肠杆菌(K12)GlpK具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的基因工程化微生物细胞，其中，所述基因工程化微生物细胞已被基因工程化为含有并表达编码所述大肠杆菌GlpK的所述功能变体的重组基因。
6.根据权利要求5所述的基因工程化微生物细胞，其中，
<...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于细胞内生物合成目的低聚糖的基因工程化微生物细胞，其中，在存在甘油作为唯一碳源和能量源的情况下培养时，所述基因工程化微生物细胞在细胞内合成目的低聚糖，其中，所述基因工程化微生物细胞包含：
2.根据权利要求1所述的基因工程化微生物细胞，其中，具有非离子化但极性的作用侧链的所述氨基酸残基选自l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-半胱氨酸、l-蛋氨酸、l-天冬酰胺和l-谷氨酰胺。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程化细菌细胞，其中，所述阴离子氨基酸残基选自l-天冬氨酸和l-谷氨酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的基因工程化微生物细胞，其中，所述功能变体与大肠杆菌(k12)glpk具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的基因工程化微生物细胞，其中，所述基因工程化微生物细胞已被基因工程化为含有并表达编码所述大肠杆菌glpk的所述功能变体的重组基因。
6.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：安德烈路易斯·罗德里格斯，克里斯汀·特罗舍尔，亨宁·弗赖格曼，马库斯·恩格勒特，伊丽莎白·施陶特格伦德曼，
申请(专利权)人：科·汉森有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。