【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于水通道蛋白4抗体检测，尤其涉及一种检测水通道蛋白4抗体的融合蛋白及其制备方法与应用。
技术介绍
1、视神经脊髓炎谱系障碍(neuromyelitis optica spectrum disorder，nmosd)是一种以视神经和脊髓受累为主的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病。该病好发于青壮年，以女性为主，具有高复发率和高致残率的特点，且易误诊为原发性开角型青光眼、黄斑病变等其他眼部疾患。如未及时诊治，多数患者遗留严重的视力障碍、肢体功能障碍及尿便障碍。
2、绝大多数nmosd患者血液中可检测出水通道蛋白4抗体(aqp4-igg)，该抗体错误地攻击中枢神经系统中的一种特定蛋白质，即水通道蛋白4(aquaporin-4，aqp4)。aqp4利用水通道蛋白家族的同源性克隆而分离出来，其在中枢神经系统分布广泛，是哺乳动物大脑中最主要的水通道蛋白。目前，人类中发现的水通道蛋白共有13种亚型，即aqp0～aqp12，aqp4是其中一种，其基因位于人类染色体18q11.2与q12.1的连接处，包含4个外显子，负责127、55、27、92位氨基酸序列的编码，3个内含子位于其间。从结构上看，位于细胞膜上的aqp4是由6个跨膜的螺旋结构组成，形成5个环形结构，其中环a、c和e位于细胞外，环b、d以及羧基、氨基末端位于细胞内，多在星型胶质细胞表达。aqp4有2种主要的亚型，m1型(32kda)和m23型(30kda)，两者的细胞外结构域相同，但m1在胞内n端有多余的22个氨基酸序列。通常aqp4会以四聚体的形式存在，m23型与m1
3、作为诊断nmosd的特异性生物标志物，aqp4-igg的发现奠定了视神经脊髓炎免疫致病的基础。目前血清aqp4-igg阳性已被纳入nmosd的诊断标准之一。因此，获取优质的靶蛋白作为检测试剂的原材料，用于检测aqp4-igg具有重要意义，有助于提高早期诊断的准确性。
4、另外，单独表达m1型或m23型蛋白用于检测试剂，容易造成漏检。因此，如何提高aqp4-igg检测的准确性是亟待解决的问题。
技术实现思路
1、鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种检测水通道蛋白4抗体的融合蛋白及其制备方法与应用，该融合蛋白能够同时检测m1型和m23型水通道蛋白4，检测水通道蛋白4抗体的灵敏度和准确性高、重复性好。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种检测水通道蛋白4抗体的融合蛋白，所述融合蛋白的核苷酸序列如seq id no.5所示。
4、本专利技术提供了一种上述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
5、将m1型aqp4的编码基因序列和m23型aqp4的编码基因序列，分别进行双酶切后，连接至骨架载体上，得到重组载体；
6、将重组载体转化至大肠杆菌中，扩增重组载体，得到扩增后的重组载体；
7、将扩增后的重组载体转染至人胚胎肾细胞hek293中，培养，得到转染后的细胞；
8、最后提取转染后的细胞中的融合蛋白。
9、优选的，所述m1型aqp4的编码基因序列如seq id no.1所示，所述m23型aqp4的编码基因序列如seq id no.3所示；所述双酶为ecori酶和xhoi酶；所述骨架载体为pet-28a(+)载体。
10、优选的，所述大肠杆菌包括大肠杆菌dh5α。
11、优选的，所述转染的方法包括：在人胚胎肾细胞hek293中加入扩增后的重组载体和pei转染试剂，混匀，静置，培养，得到转染后的细胞。
12、优选的，所述提取的方法包括：将转染后的细胞与细胞裂解液混合，反复冻融，于2～6℃、800～1200g离心5～15min取上清，上清于2～6℃、12000～16000g离心25～35min取沉淀，沉淀与膜蛋白提取液溶解，得到细胞膜蛋白溶液；将his纯化树脂与细胞膜蛋白溶液混合，得到混合液，2～6℃、800～1200g离心所述混合液5～15min，取第一沉淀树脂，清洗第一沉淀树脂，得到第二沉淀树脂，然后用含咪唑的洗脱液洗脱，离心取上清，得到融合蛋白。
13、本专利技术还提供了一种上述的融合蛋白或制备方法得到的融合蛋白在制备检测水通道蛋白4抗体产品中的应用。
14、本专利技术还提供了一种用于检测水通道蛋白4抗体的试剂盒，所述试剂盒包括上述的融合蛋白或制备方法得到的融合蛋白。
15、优选的，所述试剂盒包括elisa试剂盒。
16、优选的，所述试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记的二抗、标准品、质控品、酶底物、洗涤液和终止液。
17、相对于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
18、本专利技术提供了一种检测水通道蛋白4抗体的融合蛋白及其制备方法与应用，将检测水通道蛋白4抗体的融合蛋白作为包被抗原，能够同时检测m1型和m23型水通道蛋白4，检测水通道蛋白4抗体的灵敏度和准确性高、重复性好。本专利技术以该融合蛋白作为包被抗原制备酶联免疫吸附测定(elisa)试剂盒，检测方法简单、快速，适用于临床和科研的大规模筛查水通道蛋白4抗体。
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1.一种检测水通道蛋白4抗体的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.一种权利要求1所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，所述M1型AQP4的编码基因序列如SEQ IDNO.1所示，所述M23型AQP4的编码基因序列如SEQ ID NO.3所示；
4.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌包括大肠杆菌DH5α。
5.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，所述转染的方法包括：在人胚胎肾细胞HEK293中加入扩增后的重组载体和PEI转染试剂，混匀，静置，培养，得到转染后的细胞。
6.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，所述提取的方法包括：将转染后的细胞与细胞裂解液混合，反复冻融，于2～6℃、800～1200g离心5～15min取上清，上清于2～6℃、12000～16000g离心25～35min取沉淀，沉淀与膜蛋白提取液溶解，得到细胞膜蛋白溶液；将His纯化树脂与细胞膜蛋白溶液混合，得到混合液，2～6℃、800～12
7.权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2～6任意一项所述制备方法得到的融合蛋白在制备检测水通道蛋白4抗体产品中的应用。
8.一种用于检测水通道蛋白4抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2～6任意一项所述制备方法得到的融合蛋白。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括ELISA试剂盒。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记的二抗、标准品、质控品、酶底物、洗涤液和终止液。
...【技术特征摘要】
1.一种检测水通道蛋白4抗体的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的核苷酸序列如seq id no.5所示。
2.一种权利要求1所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，所述m1型aqp4的编码基因序列如seq idno.1所示，所述m23型aqp4的编码基因序列如seq id no.3所示；
4.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌包括大肠杆菌dh5α。
5.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，所述转染的方法包括：在人胚胎肾细胞hek293中加入扩增后的重组载体和pei转染试剂，混匀，静置，培养，得到转染后的细胞。
6.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，所述提取的方法包括：将转染后的细胞与细胞裂解液混合，反复冻融，于2～6℃、800～1200g离心5～15min取上清，上清于2～6℃、1...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴际，禄梦笛，钟运华，王子霞，孟玥，
申请(专利权)人：广东省人民医院，
类型：发明
国别省市：
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