【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种具有高乙酰化活性的酰基转移酶突变体及其应用，属于酶工程。
技术介绍
1、n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸在美容护肤和生物医药领域应用广泛，具有很高的市场需求和经济价值。目前市场上的n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸主要是羟脯氨酸与乙酰化试剂进行化学反应合成，该过程复杂，分离步骤繁琐且效率较低，导致生产成本高昂。另外，化学合成对环境造成负面影响，限制其在工业中的推广应用。
2、近年来，酶催化合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸展现出良好的发展势头。来自耻垢分枝杆菌(mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶msact因其高活性、高稳定性以及广泛的酯化反应底物范围，成为最受关注的酰基转移酶之一。公开号为cn117586979a的专利中公开了一个酰基转移酶突变体，以羟脯氨酸为底物，利用表达该技术中酰基转移酶突变体的基因工程菌株进行催化，n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸产量达到312.5mg/l以上。其中，表达突变体k97a/f154a的基因工程菌株全细胞合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的产量可达488mg/l。
3、尽管如此，n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的产率仍然较低。利用msact催化合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的研究仍处于初级阶段，酶的催化效率亟待进一步提高。此外，msact具备混杂的水解酶和酰基转移酶活性，其较高的水解酶活性阻碍了产物的积累。因此，进一步挖掘开发msact以提高其催化效率及酰基转移酶活性(at：h)是提升n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸产量
技术实现思路
1、为了进一步挖掘酰基转移酶(msact)的潜力，提高酰基转移酶的酶活，本专利技术提供了一种酰基转移酶突变体，与突变前相比，突变体对于羟脯氨酸的转化率大幅提高，进一步提高了n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的产量。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种具有高乙酰化活性的酰基转移酶突变体，所述酰基转移酶突变体在对应氨基酸序列如seq id no.1所示的酰基转移酶突变体的基础上，含有第62位、第64位中一个或多个突变位点。
3、seq id no.1：
4、makrilcfgdcltwgwvpvedgapterfapdvrwtgvlaqqlgadfevieeglsarttniddptdprlngasylpsclathlpldlviimlgtndtkayfrrtpldialgmsvlvtqvltsaggvgttypapkvlvvsppplapmphpwfqlifeggeqkttelarvysalasfmkvpffdagsvistdgvdgihfteannrdlgvalaeqvrsll
5、在本专利技术的一种实施方式中，编码氨基酸序列如seq id no.1所示的酰基转移酶突变体的核苷酸序列如seq id no.2所示。
6、seq id no.2：
7、atggccaaacgcatcttatgtttcggagactgcctgacttggggatgggttcccgtggaagacggtgctcctactgaacgctttgcgccagatgtacgctggaccggcgtattagctcagcagttaggcgctgactttgaagtcattgaggaaggtttgtctgcccgtacgacaaacatcgatgatcccaccgacccgcgtttgaatggagcgagctatcttccctcgtgcctggcaactcacttaccgctggatcttgttattatcatgttgggcacaaacgacaccaaggcgtatttccgccgcacaccccttgatattgcacttgggatgtcggtgcttgtcacacaggtcttgacatccgcggggggagtaggcacgacatatcccgcaccgaaagtattagtcgtctcgcctcctcccttggcacccatgcctcacccctggtttcaactgatttttgagggcggagaacaaaagacaacggaacttgcccgtgtgtattcagcgctggcttcgtttatgaaagtcccgttctttgatgccggtagcgtgatcagtacagacggcgtagatggtatccactttacggaggccaataaccgtgatctgggggtggcactggcggagcaagttcgctcactttta
8、其中，所述氨基酸序列seq id no.1中，第62和第64位氨基酸位点为酰基转移酶msact活性口袋附近内的氨基酸残基。
9、在本专利技术的一种实施方式中，所述酰基转移酶突变体为，将氨基酸序列如seq idno.1所示的酰基转移酶突变体的第62位的天冬氨酸突变为赖氨酸得到的，命名为：d62k；
10、在本专利技术的一种实施方式中，将氨基酸序列如seq id no.1所示的酰基转移酶突变体的第62位的天冬氨酸突变为精氨酸得到的，命名为：d62r；
11、在本专利技术的一种实施方式中，将氨基酸序列如seq id no.1所示的酰基转移酶突变体的第64位的苏氨酸突变为天冬酰胺得到的，命名为：t64n。
12、本专利技术还提供了编码上述突变体的基因或携带所述基因的重组载体。
13、本专利技术还提供了表达上述突变体或携带上述基因或所述重组载体的重组细胞。
14、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
15、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞的宿主为大肠杆菌c43(de3)。
16、本专利技术还提供了一种含有上述酰基转移酶突变体序列的重组酶催化剂，所述催化剂是以下形式中的任意一种：
17、(1)培养重组表达转化体，分离表达含有所述酰基转移酶突变体序列的重组酶的转化体细胞，得到所述重组酶催化剂；
18、(2)培养重组表达转化体，分离表达含有所述酰基转移酶突变体序列的重组酶的转化体细胞，对表达重组酶的转化体细胞进行破碎，获得细胞破碎液，得到所述重组酶催化剂；
19、(3)培养重组表达转化体，分离表达含有所述酰基转移酶突变体序列的重组酶的转化体细胞，对表达重组酶的转化体细胞进行破碎，获得细胞破碎液，将细胞破碎液经冷冻干燥而得到冻干酶粉，得到所述重组酶催化剂。
20、本专利技术还提供一种提高酰基转移酶酶活(at:h)的方法；所述at:h为酰基转移酶活性与水解活性的比值；
21、所述方法为将氨基酸序列如seq id no.1所示的酰基转移酶突变体的第62位的天冬氨酸突变为赖氨酸或精氨酸；
22、或将氨基酸序列如seq id no.1所示的酰基转移酶突变体的第64位的苏氨酸突变为天冬酰胺。
23、本专利技术还提供了一种提高n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸产量或转化率的方法，所述方法为，将所述酰基转本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有高乙酰化活性的酰基转移酶突变体，其特征在于，所述酰基转移酶突变体在对应氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酰基转移酶突变体的基础上，含有第62位、第64位中一个或多个突变位点。
2.根据权利要求1所述的酰基转移酶突变体，其特征在于，所述酰基转移酶突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酰基转移酶突变体的第62位的天冬氨酸突变为赖氨酸得到的；
3.编码权利要求1或2所述的突变体的基因或携带所述基因的重组载体。
4.表达权利要求1或2所述突变体或携带权利要求3所述基因或所述重组载体的重组细胞；优选地，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
5.一种含有权利要求1或2所述酰基转移酶突变体序列的重组酶催化剂，其特征在于，所述催化剂是以下形式中的任意一种：
6.一种提高酰基转移酶AT:H的方法，其特征在于，所述方法为将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的酰基转移酶突变体的第62位的天冬氨酸突变为赖氨酸或精氨酸；
7.权利要求1或2所述酰基转移酶突变体、权利要求3所述基因或重组载体、权利要求
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用为，将权利要求1或2所述酰基转移酶突变体或权利要求4所述重组细胞或权利要求5所述重组酶催化剂，添加至含有羟脯氨酸、酰基供体的反应体系中进行反应，制备得到N-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸；
9.一种提高N-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸产量或转化率的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1或2所述酰基转移酶突变体或权利要求4所述重组细胞或权利要求5所述重组酶催化剂，添加至含有羟脯氨酸、酰基供体的反应体系中进行反应，制备得到N-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸。
10.权利要求1或2所述的突变体、权利要求3所述的基因或重组载体、权利要求4所述的重组细胞、权利要求5所述的重组酶催化剂、权利要求6所述的方法或权利要求7所述的方法在生物材料、医药或化妆品领域中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种具有高乙酰化活性的酰基转移酶突变体，其特征在于，所述酰基转移酶突变体在对应氨基酸序列如seq id no.1所示的酰基转移酶突变体的基础上，含有第62位、第64位中一个或多个突变位点。
2.根据权利要求1所述的酰基转移酶突变体，其特征在于，所述酰基转移酶突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的酰基转移酶突变体的第62位的天冬氨酸突变为赖氨酸得到的；
3.编码权利要求1或2所述的突变体的基因或携带所述基因的重组载体。
4.表达权利要求1或2所述突变体或携带权利要求3所述基因或所述重组载体的重组细胞；优选地，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
5.一种含有权利要求1或2所述酰基转移酶突变体序列的重组酶催化剂，其特征在于，所述催化剂是以下形式中的任意一种：
6.一种提高酰基转移酶at:h的方法，其特征在于，所述方法为将氨基酸序列如seq idno.1所示的酰基转移酶突变体的第62位的天冬氨酸突变为赖氨酸或精氨酸；
7.权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：程景方，孙超，孙付保，刘靓，胡芸，
申请(专利权)人：可莱尼化妆品科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。