【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学和生物工程领域，具体涉及一种催化活性提高的甲醇脱氢酶突变体及其应用。
技术介绍
1、生物制造是推动工业制造向可持续发展模式演变的重要方式，但是目前生物制造高度依赖粮食原料。国家统计局统计我国发酵用粮约2亿吨，约相当于粮食总产量的30%，原料供给已经成为生物制造的瓶颈之一。甲醇是煤炭化工、页岩气化工和工农业废弃物气化的初级平台产品，是一种天然的一碳化合物，具有来源广泛、价格低廉、转化率高等优点。与糖类相比，其价格较低且平稳，且还具有平均碳原子还原程度高等优势，可为生物合成过程提供更多的还原力，参与生物转化具有明显优势。因此，甲醇是生物制造大宗化学品的理想原料，在未来有着巨大的开发潜力和广阔的发展前景，研究甲醇的生物转化具有重大的经济学与社会学意义。
2、在微生物一碳代谢过程中，甲醇首先由甲醇脱氢酶(methanol dehydrogenase，mdh)催化生成甲醛。随后，甲醛进一步通过核酮糖单磷酸途径(ribulose monophosphatepathway，rump)、木酮糖单磷酸途径(xylulose monophosphate pathway，xump)和丝氨酸循环(serine pathway)等不同的同化途径合成细胞生长代谢所需的能量和碳骨架，或者通过异化途径氧化生成co2。
3、然而，现有技术中，由于mdh的酶学性质欠佳，且mdh催化逆反应更容易发生，致使甲醇氧化成为限制甲醇生物转化效率的关键反应。因此，本领域亟需对mdh进行定向进化，以获得更高活性的mdh，从而弥补甲
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种催化活性提高的甲醇脱氢酶突变体。本专利技术基于来源于嗜热脂肪芽孢杆菌( bacillus stearothermophilus dsm 2334)的甲醇脱氢酶mdhbs（以下简称野生型甲醇脱氢酶），通过构建甲醇脱氢酶mdhbs全基因随机突变文库，经筛选及测序获得3种体内甲醇催化活性提高的突变体mdhv79a、mdhn214d+e309k、mdhk72t+t153p；同时对最优突变体mdhk72t+t153p拆分出的mdhk72t和mdht153p进行单位点活性的探究；进一步采用定点饱和突变策略构建t153饱和突变文库并通过测序验证，筛选得到催化活性提高的突变体mdht153s和mdht153v。这些突变体在甲醇生物利用中具有较好的应用前景。
2、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案施行：
3、在第一方面，本专利技术提供一种甲醇脱氢酶突变体，所述甲醇脱氢酶突变体选自如下任一种：
4、(a)其氨基酸序列由seq id no: 1所示序列突变而来，在选自下组的一个或多个氨
5、基酸残基位点发生突变：153位、72位、79位、214位、309位；并且与seq id no: 1所示的甲醇脱氢酶相比，具有提高的催化活性；
6、或
7、(b)所述甲醇脱氢酶突变体与(a)所述的氨基酸序列具有95％，优选98％，更优选99％
8、的序列相同性，并且具有(a)所述甲醇脱氢酶突变体的功能，其中对应于seq idno: 1所示氨基酸序列的153位、72位、79位、214位、和/或309位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列中的相同；
9、或
10、(c)所述甲醇脱氢酶突变体由在(a)所述的氨基酸序列的c末端和/或n末端添加或缺失1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基而组成，并且具有(a)所述甲醇脱氢酶突变体的功能，其中对应于seq id no: 1所示氨基酸序列的153位、72位、79位、214位、和/或309位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列中的相同。
11、根据本专利技术的实施方案，所述甲醇脱氢酶突变体的氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点突变为以下所示的氨基酸残基：
12、153位: pro或ser或val；
13、72位: thr；
14、79位: ala；
15、214位: asp;
16、309位: lys。
17、在具体的实施方式中，所述甲醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no: 3-9任一项所示。
18、在第二方面，本专利技术提供一种编码第一方面所述的甲醇脱氢酶突变体的多核苷酸。
19、在第三方面，本专利技术提供一种表达载体，所述表达载体包含本专利技术第二方面所述的多核苷酸。
20、在第四方面，本专利技术提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本专利技术第三方面所述的表达载体或者其基因组中整合有本专利技术第二方面所述的甲醇脱氢酶突变体的多核苷酸。
21、在优选的实施方式中，所述宿主细胞是细菌；更优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌
22、( escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌( corynebacterium glutamicum)、或枯草芽孢杆菌( bacillus subtilis)；最优选地，所述宿主细胞是谷氨酸棒杆菌( corynebacterium glutamicum)。
23、在第五方面，本专利技术提供本专利技术第一方面所述的甲醇脱氢酶突变体、本专利技术第二方面所述的多核苷酸、本专利技术第三方面所述的表达载体或者本专利技术第四方面所述的宿主细胞在甲醇生物转化中的应用。
24、本专利技术的有益效果
25、本专利技术得到一系列催化活性显著提高的甲醇脱氢酶突变体，酶活力测定中，各突变体的 v max和比酶活力与野生型甲醇脱氢酶相比均达到最高2.5倍。在甲醇生物利用中，mdht153p和mdht153s突变体单位od600nm的甲醛浓度是野生型对照的1.6-2.4倍。本专利技术的突变体具有更高的催化活性，有利于加快甲醇的生物转化，从而具备显著的经济价值和社会价值，为实现工业大规模的甲醇生物转化奠定了基础。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种甲醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲醇脱氢酶突变体选自如下任一种：
2.根据权利要求1所述的甲醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲醇脱氢酶突变体的氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点突变为以下所示的氨基酸残基：
3. 根据权利要求2所述的甲醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。
4.一种编码权利要求1-3任一项所述的甲醇脱氢酶突变体的多核苷酸。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求5所述的表达载体或者其基因组中整合有权利要求4所述的甲醇脱氢酶突变体的多核苷酸。
7. 根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是细菌；更优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；最优选地，所述宿主细胞是谷氨酸棒杆菌(Co
8.权利要求1-3任一项所述的甲醇脱氢酶突变体、权利要求4所述的多核苷酸、权利要求5所述的表达载体、或者6或7所述的宿主细胞在甲醇生物转化中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种甲醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲醇脱氢酶突变体选自如下任一种：
2.根据权利要求1所述的甲醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲醇脱氢酶突变体的氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点突变为以下所示的氨基酸残基：
3. 根据权利要求2所述的甲醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no: 4所示。
4.一种编码权利要求1-3任一项所述的甲醇脱氢酶突变体的多核苷酸。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求5所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑平，王钰，钱瑾，孙际宾，凡立稳，周文娟，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。