一种布鲁菌减毒活疫苗菌株M5∆lysR21及其减毒方法与应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种布鲁菌减毒活疫苗菌株M5ΔlysR21及其减毒方法与应用，所述M5ΔlysR21由羊种布鲁菌M5株缺失lysR21基因后得到，所述布鲁菌减毒活疫苗菌株MSΔlysR21保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2024年11月21日，保藏编号为CGMCC NO.32791。本发明专利技术发现，lysR21基因与布鲁菌毒力有关，缺失lysR21基因可减弱布鲁菌的毒力，能显著降低布鲁菌在细胞内和小鼠体内的存活能力，表现出比疫苗株更强的免疫保护性，可作为预防动物布鲁菌病的候选减毒活疫苗菌株，具有潜在的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物，具体涉及一种布鲁菌减毒活疫苗菌株m5δlysr21及其减毒方法与应用。

技术介绍

1、布鲁菌病，简称“布病”，是由布鲁菌感染引起的人兽共患传染病。布鲁菌为革兰阴性胞内寄生菌，以羊种布鲁菌、牛种布鲁菌和猪种布鲁菌较为常见。人感染布鲁菌的临床表现多样，可见发热、多汗、乏力、关节肌肉疼痛等症状，治疗不当或治疗不及时可转为慢性，导致疾病迁延不愈。家畜感染布鲁菌可出现公畜睾丸或附睾炎，母畜流产、早产或死胎。

2、布病在全世界广泛流行和分布，据报道，全球有近170个国家和地区的人、畜中存在布鲁菌病。近年来，由于动物饲养量增加、动物贸易和流通频繁等因素，布鲁菌病在世界范围内呈回升趋势，是全球特别是发展中国家面临的公共卫生问题。

3、布病的预防和控制主要依赖于检疫、扑杀销毁和疫苗免疫。接种疫苗是预防畜间布病最有效的方式。布病疫苗的的研发可以追溯到20世纪初，随着对布病致病机制的深入了解，疫苗的研制也经历了灭活疫苗、减毒活疫苗、突变株疫苗以及新型疫苗的演变。其中减毒活疫苗作用持久且高效，目前我国使用的疫苗大多为减毒活疫苗。然而，目前存在的这些减毒疫苗存在一定缺陷，如毒性大、返毒现象严重等。另外，针对人的布病并没有非常有效的疫苗和治疗方法，而且在给动物接种疫苗的过程中也有传播给人的风险。

4、因此，随着对布鲁菌致病机制研究的深入以及相关分子生物学技术的发展与应用，研发出能够克服现有疫苗的缺陷、对动物和人类均安全有效的疫苗是控制布病流行的关键。

技术实现思路</p>

1、本专利技术的目的在于提供一种布鲁菌减毒活疫苗菌株m5δlysr21及其减毒方法与应用，其通过敲除lysr21基因后所构建的m5δlysr21株比原始布鲁菌m5株的毒力减弱，可作为预防动物布鲁菌病的候选减毒活疫苗菌株。

2、本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的：

3、本专利技术提供了一种布鲁菌减毒活疫苗菌株m5δlysr21，所述布鲁菌减毒活疫苗菌株m5δlysr21由羊种布鲁菌m5株缺失lysr21基因后得到，所述布鲁菌减毒活疫苗菌株m5δlysr21保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2024年11月21日，保藏编号为cgmcc no.32791，分类命名为马耳他布鲁氏菌brucella melitensis。

4、本专利技术还提供了一种布鲁菌减毒方法，所述方法包括将布鲁菌中lysr21基因敲除或缺失的步骤，所述布鲁菌为羊种布鲁菌m5株。

5、进一步的，具体包括以下步骤：

6、(1)pcr扩增lysr21基因上、下游同源臂片段，扩增完成后融合pcr将两个片段融合，得到融合片段；

7、(2)通过同源重组的方法，将融合片段与线性化的自杀性质粒pkb进行连接，得到重组质粒，经筛选、提取后得到自杀性质粒pkb-δlysr21；

8、(3)将自杀性质粒pkb-δlysr21电转化至羊种布鲁菌m5感受态细胞中，经双重筛选后得到m5δlysr21缺失株。

9、进一步的，在步骤(1)中，所述pcr扩增lysr21基因上、下游同源臂片段时所采用的引物序列如seq id no.1-4所示，其中，引物序列如seq id no.1所示的lysr21-uf和seq idno.2所示的lysr21-ur用于扩增上游同源臂片段，引物序列如seq id no.3所示的lysr21-df和seq id no.4所示的lysr21-dr用于扩增下游同源臂片段，所述融合pcr使用的引物组为序列如seq id no.1所示的lysr21-uf和seq id no.4所示lysr21-dr。

10、进一步的，在步骤(2)中，所述筛选的方法为将所述重组质粒转至大肠杆菌dh5a感受态细胞中，依次经含卡那霉素的lb固体培养基和液体培养基筛选卡那霉素抗性菌株，然后进行pcr菌液鉴定，并提取pkb-δlysr21自杀性质粒。

11、进一步的，在步骤(3)中，所述双重筛选的方法为：将步骤(2)中提取的自杀性质粒pkb-δlysr21电转化至布鲁菌感受态细胞中，产物涂布于含卡那霉素的tsa固体培养基，挑取单克隆细菌于tsb液体培养基培养后，再经过含5％蔗糖的tsa固体培养基进行负向筛选，挑取单克隆菌落于tsb液体培养基培养后，使用内侧鉴定引物和外侧鉴定引物，pcr菌液鉴定m5δlysr21缺失株。

12、进一步的，所述内侧鉴定引物为序列如seq id no.5所示的inlysr21-f和seq idno.6所示的inlysr21-r；所述外侧鉴定引物为序列如seq id no.7所示的outlysr21-f和seq id no.8所示的outlysr21-r。

13、本专利技术还提供了一种所述的布鲁菌减毒活疫苗菌株m5δlysr21或利用所述布鲁菌减毒方法所制得的减毒布鲁菌在制备预防布鲁菌病的制剂中的应用。

14、进一步的，所述制剂为布鲁菌减毒活疫苗。

15、有益效果：

16、(1)本专利技术发现，lysr21基因缺失会影响布鲁菌的基本表型，如抵抗氧化应激能力、抵抗氮化应激能力均显著降低。

17、(2)本专利技术发现，lysr21基因与布鲁菌的毒力有关，lysr21基因缺失可减弱布鲁菌的毒力，缺失后能显著降低布鲁菌在细胞内和小鼠体内的存活能力，具有潜在的应用价值。

18、(3)构建的m5δlysr21基因缺失株与原始的布鲁菌m5株相比，表现出毒力减弱，与m5-90δ26疫苗株相比，表现出更强的免疫保护性，可作为预防动物布鲁菌病的候选减毒活疫苗菌株。

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【技术保护点】

1.一种布鲁菌减毒活疫苗菌株M5ΔlysR21，其特征在于，所述布鲁菌减毒活疫苗菌株M5ΔlysR21由羊种布鲁菌M5株缺失lysR21基因后得到，所述布鲁菌减毒活疫苗菌株M5ΔlysR21保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2024年11月21日，保藏编号为CGMCC NO.32791。

2.一种布鲁菌减毒方法，其特征在于，所述方法包括将布鲁菌中lysR21基因敲除或缺失的步骤，所述布鲁菌为羊种布鲁菌M5株。

3.如权利要求2所述的布鲁菌减毒方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

4.如权利要求3所述的布鲁菌减毒方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述PCR扩增lysR21基因上、下游同源臂片段时所采用的引物序列如SEQ ID NO.14所示，其中，引物序列如SEQ ID NO.1所示的LysR21-UF和SEQ ID NO.2所示的LysR21-UR用于扩增上游同源臂片段，引物序列如SEQ ID NO.3所示的LysR21-DF和SEQ ID NO.4所示的LysR21-DR用于扩增下游同源臂片段，所述融合PCR使用的引物组为序列如SEQ ID NO.1所示的LysR21-UF和SEQID NO.4所示LysR21-DR。

5.如权利要求3所述的布鲁菌减毒方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述筛选的方法为将所述重组质粒转至大肠杆菌DH5a感受态细胞中，依次经含卡那霉素的LB固体培养基和液体培养基筛选卡那霉素抗性菌株，然后进行PCR菌液鉴定，并提取pKB-ΔlysR21自杀性质粒。

6.如权利要求3所述的布鲁菌减毒方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述双重筛选的方法为：将步骤(2)中提取的自杀性质粒pKB-ΔlysR21电转化至布鲁菌感受态细胞中，产物涂布于含卡那霉素的TSA固体培养基，挑取单克隆细菌于TSB液体培养基培养后，再经过含5％蔗糖的TSA固体培养基进行负向筛选，挑取单克隆菌落于TSB液体培养基培养后，使用内侧鉴定引物和外侧鉴定引物，PCR菌液鉴定M5ΔlysR21缺失株。

7.如权利要求6所述的布鲁菌减毒方法，其特征在于，所述内侧鉴定引物为序列如SEQID NO.5所示的InLysR21-F和SEQ ID NO.6所示的InLysR21-R；所述外侧鉴定引物为序列如SEQ ID NO.7所示的OutLysR21-F和SEQ ID NO.8所示的OutLysR21-R。

8.如权利要求1所述的布鲁菌减毒活疫苗菌株M5ΔlysR21或利用权利要求2-7任一项所述布鲁菌减毒方法所制得的减毒布鲁菌在制备预防布鲁菌病的制剂中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述制剂为布鲁菌减毒活疫苗。

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【技术特征摘要】

1.一种布鲁菌减毒活疫苗菌株m5δlysr21，其特征在于，所述布鲁菌减毒活疫苗菌株m5δlysr21由羊种布鲁菌m5株缺失lysr21基因后得到，所述布鲁菌减毒活疫苗菌株m5δlysr21保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2024年11月21日，保藏编号为cgmcc no.32791。

2.一种布鲁菌减毒方法，其特征在于，所述方法包括将布鲁菌中lysr21基因敲除或缺失的步骤，所述布鲁菌为羊种布鲁菌m5株。

3.如权利要求2所述的布鲁菌减毒方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

4.如权利要求3所述的布鲁菌减毒方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述pcr扩增lysr21基因上、下游同源臂片段时所采用的引物序列如seq id no.14所示，其中，引物序列如seq id no.1所示的lysr21-uf和seq id no.2所示的lysr21-ur用于扩增上游同源臂片段，引物序列如seq id no.3所示的lysr21-df和seq id no.4所示的lysr21-dr用于扩增下游同源臂片段，所述融合pcr使用的引物组为序列如seq id no.1所示的lysr21-uf和seqid no.4所示lysr21-dr。

5.如权利要求3所述的布鲁菌减毒方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：田明星，李梦思，王少辉，鲍衍清，祁晶晶，胡剑刚，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，
类型：发明
国别省市：