【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白提取，具体涉及槐耳清膏中性水溶性多糖的分离提取及新应用。
技术介绍
1、慢性肾脏病(chronic kidney disease，ckd)是指各种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍，包括肾小球滤过率正常和不正常的病理损伤、血液或尿液成分异常，及影像学检查异常，或不明原因肾小球滤过率(glomerular filtration rate，gfr)下降超过3个月。ckd的病程呈不可逆性的慢性进行性发展，最终导致终末期肾病(end stage renaldisease，esrd)。esrd患者需要接受终身肾脏替代治疗(包括维持性血液透析、腹膜透析或肾移植)，不但严重影响患者的生活质量，为患者及其家庭带来沉重的精神压力和经济负担，还消耗了巨大的社会医疗资源。肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，rif)是各种慢性肾脏疾病进展为终末期肾衰竭共同的病变过程，病理特征为正常肾间质和肾小管结构被大量聚集的细胞外基质(extracellular matrix，ecm)所代替，如i、iii、iv型胶原、纤维连接蛋白(fibronectin，fn)、层黏连蛋白(laminin，ln)等。因此抑制肾间质纤维化的进展则是延缓慢性肾脏病患者发展为esrd的重要途径。
2、槐耳，为多孔菌科栓菌属槐栓菌trametes robiniophila murr.的子实体，槐耳清膏((huaier)是槐耳菌质发酵后的热水提取物，其粗提物的主要活性成分是多糖蛋白。一直以来，槐耳颗粒在各种癌症或癌症术后的辅助治疗
技术实现思路
1、基于以上背景，本专利技术的目的是提供一种槐耳清膏中提取的中性水溶性多糖，其制备方法及应用。
2、为实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术第一方面提供了一种分离提取中性水溶性多糖的方法，所述方法的步骤包括：
4、(1)将槐耳清膏水溶液除去蛋白，去除色素和小分子，得到总多糖；(2)将(1)得到的总多糖加水溶解，纯化洗脱，苯酚硫酸法进行追踪检测，根据峰型分别收集，浓缩、透析、冷冻干燥，得到多糖组分；(3)将(2)中得到的多糖组分加水溶解，层析柱纯化，收集对称峰，收集液通过旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥得到纯化多糖。
5、在本专利技术中，术语“多糖”是指由糖苷键结合的糖链，由单糖单元组成的聚合糖高分子碳水化合物。多糖的结构通常由多种单糖单元组成，如如三碳糖的甘油醛；四碳糖的赤藓糖、苏力糖；五碳糖的阿拉伯糖、核糖、木糖、来苏糖；六碳糖的葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖。由相同单糖组成的多糖为同多糖，以不同单糖组成的多糖为杂多糖。
6、术语“中性多糖”是指含有两种或两种以上不含有机酸的不同的糖基单体构成的聚合物。酸性多糖则较为复杂，除含有两种或两种以上糖基单体外，还有一种或两种以上的糖醛酸单体。天然产物中存在的多糖大多为中性多糖和酸性多糖，碱性多糖则只有甲壳素/壳聚糖。术语“水溶性多糖”则是指在水中可以溶解的一类多糖物质，通常具有较高的分子量和复杂的化学结构。水溶性多糖广泛存在于自然界中，包括植物、海藻、真菌、细菌和动物组织等。
7、在本专利技术中，除去蛋白的方法可以是sevag法，离心超滤法，酶解法，聚丙烯酰胺凝胶电泳法，氯化胍法，细胞膜破碎法等。在一些实施例中，除去蛋白的方法为sevag法，所述“sevag法”是指一种从混合体系中去除蛋白质杂质的方法，用加有少量异戊醇或辛醇的氯仿溶液对含有蛋白质杂质的混合物反复振荡，使蛋白质变性沉淀而被除去。
8、进一步，所述除去蛋白的具体步骤为：四倍溶液体积无水乙醇4℃沉淀24小时，1000da透析袋透析至透析液澄清，sevag试剂脱蛋白。
9、在本专利技术中，去除色素的方法可以是柱层析法，吸附法，氧化法等。去除小分子的方法可以是超滤法，透析法等。在一些实施例中，使用吸附法去除色素，透析法去除小分子。
10、进一步，所述去除色素和小分子的具体步骤为：1000da透析袋透析一周，ab-8大孔树脂脱色素，1kd孔径透析袋透析，冷冻干燥，得到总多糖。
11、在本专利技术中，所述“纯化”的方法包括分步沉淀法，盐析法，金属络合物法，纤维素柱层析法，季胺盐沉淀法，纤维素阴离子交换剂柱层析法，凝胶柱层析法和制备性区域电泳等。在一些实施例中，纯化的方法为凝胶柱层析法。所述“洗脱”可以是恒定浓度的洗脱液洗脱，也可以是不同浓度的呈线性的洗脱液进行洗脱。在一些实施例中，洗脱使用不同浓度的呈线性的洗脱液进行洗脱。
12、进一步，所述纯化洗脱的具体步骤为：加热，斡旋，12000rpm离心，取上清液上样至deae sepharose fast flow纯化柱，调整流速为15ml/min的蒸馏水进行洗脱，洗脱液为水、0.2m～1.0m nacl水溶液。
13、进一步，所述洗脱液为水、0.2m nacl水溶液、0.5m nacl水溶液、1.0m nacl水溶液。
14、在本专利技术中，层析柱可以是凝胶层析柱或离子交换层析柱。凝胶层析柱可以是琼脂糖凝胶柱，聚丙烯酰胺凝胶柱，葡聚糖凝胶柱。
15、进一步，所述层析柱为sephadexg-200葡聚糖凝胶柱。
16、本专利技术第二方面提供了一种根据本专利技术第一方面所述的方法获得的中性水溶性多糖。
17、进一步，所述中性水溶性多糖的单糖组成包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖，其摩尔比为11.4:5.8:10.5:22.3。
18、进一步，所述中性水溶性多糖的分子式为：
19、
20、进一步，所述中性水溶性多糖的重均分子量为2.0×104～2.2×104da。
21、进一步，所述中性水溶性多糖的重均分子量为2.17×104da。
22、在本专利技术中，阿拉伯糖化学式为c5h10o5，原本从一种叫阿拉伯树分泌的胶体中经复杂的化学和物理方法分离提取出来的一种左旋单糖，有八种异构体，如β-d-阿拉伯糖、β-l-阿拉伯糖等。半乳糖分子式为c6h12o6，常存在于奶类产品或甜菜中，常以d-半乳糖苷的形式存在于大脑和神经组织中。葡萄糖分子式为c6h12o6，在水溶液中，葡萄糖在小程度上以开链形式存在，主要以α或β-吡喃糖的形式存在，且这两者可以相互转换。从水溶液中，可以结晶出已知的三种形式：α-葡萄吡喃糖、β-葡萄吡喃糖和α-葡萄吡喃糖单水合物。甘露糖分子式为c6h12o6，又名d-甘露糖，可由富含d-甘露糖的聚糖(象牙棕榈子、酵母甘露聚糖等)水解制备。也可由d-甘露醇(海带制碘工业的副产品)在亚铁离子存在下，用过氧化氢氧化合成。也可由d-葡萄糖差向异构化，或由d-阿拉伯糖增长碳链等方法制备。
23、本专利技术第三方面提供了本专利技术第二方面所述的中性水溶性多糖的应用，所述应用包括如下任一项：
24、1)在制备治疗或延缓肾间质纤维化本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分离提取中性水溶性多糖的方法，其特征在于，所述方法的步骤包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述除去蛋白的具体步骤为：四倍溶液体积无水乙醇4℃沉淀24小时，1000Da透析袋透析至透析液澄清，Sevag试剂脱蛋白；
3.一种根据权利要求1-2任一项所述的方法获得的中性水溶性多糖。
4.根据权利要求3所述的中性水溶性多糖，其特征在于，所述中性水溶性多糖的单糖组成包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖，其摩尔比为11.4:5.8:10.5:22.3；优选地，所述中性水溶性多糖的分子式为：
5.根据权利要求4所述的中性水溶性多糖，其特征在于，所述中性水溶性多糖的重均分子量为2.0×104～2.2×104Da；
6.权利要求3-5任一项所述的中性水溶性多糖的应用，其特征在于，所述应用包括如下任一项：
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肾间质纤维化包括动脉性肾硬化引发的肾间质纤维化、良性肾硬化引发的肾间质纤维化、恶性肾硬化引发的肾间质纤维化、叶酸诱导的小鼠肾间质纤维化、腺嘌呤诱导的小鼠肾
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述慢性肾脏病包括原发性肾小球肾炎、高血压肾小动脉硬化、糖尿病肾病、继发性肾小球肾炎、肾小管间质病变、缺血性肾病、遗传性肾病等原因引发的慢性肾脏病；
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肾小管上皮细胞形态改变是由Tgfb1刺激引起的；
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体；
...【技术特征摘要】
1.一种分离提取中性水溶性多糖的方法，其特征在于，所述方法的步骤包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述除去蛋白的具体步骤为：四倍溶液体积无水乙醇4℃沉淀24小时，1000da透析袋透析至透析液澄清，sevag试剂脱蛋白；
3.一种根据权利要求1-2任一项所述的方法获得的中性水溶性多糖。
4.根据权利要求3所述的中性水溶性多糖，其特征在于，所述中性水溶性多糖的单糖组成包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖，其摩尔比为11.4:5.8:10.5:22.3；优选地，所述中性水溶性多糖的分子式为：
5.根据权利要求4所述的中性水溶性多糖，其特征在于，所述中性水溶性多糖的重均分子量为2.0×104～2.2×104da；
6.权利要求3-5任一项所述的中性水溶性多糖的应用，其特征在于，所述应用包括如下任一项...
【专利技术属性】
技术研发人员：林洪丽，何慧，王伟东，
申请(专利权)人：大连医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：
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