【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因编辑，具体涉及一种靶向hmgb1基因序列的sirna、hmgb1敲低细胞模型及其构建方法和应用。
技术介绍
1、高迁移率族蛋白b1(hmgb1)是一种丰富且普遍表达的核蛋白，广泛参与dna修复、基因转录等生物学过程。近年来，研究发现hmgb1在免疫炎症反应中发挥关键作用，特别是在脓毒症等急性炎症疾病中；具体地，hmgb1通过受体(如tlr4或rage)激活免疫细胞，从而导致过度的炎症反应；所以，敲低hmgb1基因的表达可能会有效调控免疫反应，减少炎症损伤。
2、基于上述，构建一种hmgb1基因敲低的细胞模型对研究脓毒症等急性炎症疾病具有重要意义。而目前小鼠骨髓来源巨噬细胞(bmdm)是研究免疫反应和炎症机制的体外模型，其在研究脓毒症等免疫病理过程中具有重要作用。此外，bmdm可以较好地模拟体内巨噬细胞的功能，可以广泛用于研究免疫应答和炎症反应。因此，构建一种hmgb1基因敲低的骨髓来源巨噬细胞模型有助于对脓毒症等急性炎症疾病的研究。
3、小干扰rna(sirna)是一种高效的基因沉默工具，能够特异性地抑制目标基因的表达。在bmdm中使用sirna敲低hmgb1，能够深入探讨其在免疫炎症中的作用，为脓毒症等疾病的研究提供更加可靠的细胞模型。
技术实现思路
1、本专利技术就是设计了三条靶向hmgb1基因序列的sirna以及将其利用在hmgb1敲低细胞模型的构建中，该sirna可以有效敲除细胞中的hmgb1基因序列，且敲低效率在60％以上，最高可
2、为了达到上述目的，本专利技术可以采用以下技术方案:
3、本专利技术一方面提供一种靶向hmgb1基因序列的sirna，选自以下sirna中任一种：
4、第一sirna，其序列如seq id no:1和seq id no:2所示；或
5、第二sirna，其序列如seq id no:3和seq id no:4所示；或
6、第三sirna，其序列如seq id no:5和seq id no:6所示。
7、本专利技术再一方面提供一种hmgb1敲低细胞模型的构建方法，包括：使用本专利技术中的sirna对细胞内的hmgb1基因序列进行敲低得到hmgb1敲低细胞模型。
8、优选地，本专利技术中的构建方法包括：(1)将转染试剂进行涡旋处理；(2)将处理后的转染试剂和sirna混合反应得转染复合物；(3)转染混合物与细胞混合，反应得hmgb1敲低细胞模型。
9、优选地，本专利技术中的构建方法满足以下条件中的一种或多种：(i)被转染细胞为原代细胞；(ii)被转染细胞为巨噬细胞；(iii)转染试剂为interferin转染试剂。
10、更优选地，上述巨噬细胞来源于动物骨髓。
11、更优选地，上述动物为小鼠。
12、优选地，上述来源于动物骨髓的巨噬细胞的提取方法包括：(a)将动物四肢胫骨和/或股骨放置在含有预冷pbs环境中，冲洗骨髓腔，冲洗液离心后得沉淀物；(b)将沉淀物加入培养基中悬浮沉淀，培养得巨噬细胞；其中，培养基中含有gm-csf。
13、更优选地，上述步骤(a)中，使用注射器冲洗骨髓腔，注射器的针头孔径为22；和/或步骤(b)中，培养基为dmem完全培养基；和/或gm-csf的浓度为8ng/ml-12ng/ml。
14、本专利技术再一方面提供一种hmgb1敲低细胞模型，其由本专利技术中的构建方法构建得到。
15、本专利技术再一方面提供一种本专利技术中的hmgb1敲低细胞模型在作为或制备脓毒症细胞模型、肿瘤细胞模型或自身免疫性疾病细胞模型中的应用。
16、本专利技术有益效果包括：
17、(1)本专利技术中提供的sirna均可以靶向hmgb1基因并对其进行敲低，其中序列如seqid no:1和seq id no:2所示的第一sirna(以下也称sirna mhmgb1-216或si-hmgb1-216)的敲低效率最高，可以达到71.89％；其次是如seq id no:3和seq id no:4所示的第二sirna(以下也称sirna mhmgb1-547或si-hmgb1-547)，其敲低效率可以达到69.73％；最后是如seq id no:5和seq id no:6所示的第三sirna(以下也称sirna mhmgb1-797或si-hmgb1-797)，其敲低效率可以达到62.12％。
18、(2)基于本专利技术中的sirna构建hmgb1敲低细胞模型的方法简单，快捷，且构建时间短。
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1.靶向HMGB1基因序列的siRNA，其特征在于，选自以下siRNA中任一种：
2.一种HMGB1敲低细胞模型的构建方法，其特征在于，包括：使用权利要求1所述的siRNA对细胞内的HMGB1基因序列进行敲低得到HMGB1敲低细胞模型。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，包括：(1)将转染试剂进行涡旋处理；(2)将处理后的转染试剂和siRNA混合反应得转染复合物；(3)转染混合物与细胞混合，反应得HMGB1敲低细胞模型。
4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，构建方法满足以下条件中的一种或多种：
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，巨噬细胞来源于动物骨髓。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，动物为小鼠。
7.根据来5或6所述的构建方法，其特征在于，来源于动物骨髓的巨噬细胞的提取方法包括：
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤(a)中，使用注射器冲洗骨髓腔，注射器的针头孔径为22；和/或步骤(b)中，培养基为DMEM完全培养基；和/或GM-
9.HMGB1敲低细胞模型，其特征在于，由权利要求1至8中任一项权利要求所述的构建方法构建得到。
10.权利要求9所述的HMGB1敲低细胞模型在作为或制备脓毒症细胞模型、肿瘤细胞模型或自身免疫性疾病细胞模型中的应用。
...【技术特征摘要】
1.靶向hmgb1基因序列的sirna，其特征在于，选自以下sirna中任一种：
2.一种hmgb1敲低细胞模型的构建方法，其特征在于，包括：使用权利要求1所述的sirna对细胞内的hmgb1基因序列进行敲低得到hmgb1敲低细胞模型。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，包括：(1)将转染试剂进行涡旋处理；(2)将处理后的转染试剂和sirna混合反应得转染复合物；(3)转染混合物与细胞混合，反应得hmgb1敲低细胞模型。
4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，构建方法满足以下条件中的一种或多种：
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，巨噬细胞来源于动物骨...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙航，程莎，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：
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