【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于合成生物学，具体涉及一种染色体跨物种高效转移的方法及其应用。
技术介绍
1、染色体转移的传统方法主要有显微注射法、阳离子脂质体转染法、peg介导的细胞融合法和微细胞法等。然而，这些技术都有着较大的局限性，例如复杂的预处理步骤、极低的通量或成功率(低于5％)、不可控的融合过程与结果、对受体细胞的无选择性以及可预期的细胞毒性等。因此，亟需研发一种高效的跨物种染色体转移技术，为后续的合成生物学发展提供理论基础。
2、目前，已有科学家尝试了改良性酵母球浆体融合代替传统的微细胞法以转移酵母内合成的染色体，这种方式不仅避开了显微注射和脂质体法将大片段dna载体暴露在外受剪切力的风险，同时这种方法可以不受dna片段大小的影响。但是，动物细胞与酵母细胞融合时，动物细胞周围真菌的存在会激活细胞内的免疫防御通路，大量酵母细胞和哺乳细胞共孵育时激活的一系列的细胞免疫和细胞死亡事件会影响染色体的传递效率，且细胞的具体死亡方式尚不明确。因此，优化共孵育条件，如何规避细胞的大量死亡，对跨物种染色体转移技术的高效性十分重要。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种染色体跨物种高效转移的方法，可以优化基于膜融合的共孵育体系的染色体转移效率。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种染色体跨物种高效转移的方法，包括以下步骤：酵母细胞采用酵母溶壁酶消化得到酵母细胞原生质体，酵母细胞原生
4、优选的，所述凋亡抑制剂z-vad-fmk的工作浓度为10～40μm；所述坏死抑制剂necrostatin-1的工作浓度为100～400μm。
5、优选的，所述消化时间为10～60min，所述酵母溶壁酶的工作浓度为60～300u/ml。
6、优选的，在共孵育培养前，所述酵母细胞原生质体加入抗真菌药培养；所述抗真菌药为0～25ng/μl的卡泊芬净+0～25ng/μl米卡芬净。
7、优选的，所述酵母细胞原生质体和动物细胞的效靶比为1～100:1。
8、优选的，所述表达人源ace2的质粒元件还包括egfp荧光报告元件、gal1启动子元件、cyc1终止子元件和irpf荧光报告元件。
9、优选的，所述酵母细胞包括酿酒酵母by4742。
10、优选的，所述动物细胞选自hep3b、plc、mcf7、hek293t、hela和u2os中的任意一种。
11、本专利技术还提供了上述方法在酵母细胞与动物细胞融合中的应用。
12、本专利技术还提供了上述方法在基因合成、基因递送中的应用。
13、与现有技术相比，本专利技术的技术方案的有益效果如下：
14、本专利技术通过调整酵母的消化和诱导时间、两种细胞共孵育的效靶比、加入相关信号通路抑制剂，优化基于膜融合的共孵育体系的染色体转移效率。本专利技术所述方法具有实用性，能增加染色体转移后融合细胞的存活率；本专利技术所述方法具有通用性，可以很好的移植性和兼容性，理论上能应用于各种细胞；本专利技术所述方法具有耐受性，坏死和凋亡抑制剂可以特异性靶向抑制底层哺乳动物细胞的死亡信号通路，提高靶细胞对异源染色体的承受程度。
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1.一种染色体跨物种高效转移的方法，其特征在于，包括以下步骤：酵母细胞采用酵母溶壁酶消化得到酵母细胞原生质体，酵母细胞原生质体和动物细胞共孵育培养，共孵育培养时加入凋亡抑制剂Z-VAD-FMK或坏死抑制剂Necrostatin-1；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凋亡抑制剂Z-VAD-FMK的工作浓度为10～40μM；所述坏死抑制剂Necrostatin-1的工作浓度为100～400μM。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化时间为10～60min，所述酵母溶壁酶的工作浓度为60～300U/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在共孵育培养前，所述酵母细胞原生质体加入抗真菌药培养；所述抗真菌药为0～25ng/μL的卡泊芬净+0～25ng/μL米卡芬净。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母细胞原生质体和动物细胞的效靶比为1～100:1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达人源ACE2的质粒元件还包括EGFP荧光报告元件、GAL1启动子元件、CYC1终
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母细胞包括酿酒酵母BY4742。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物细胞选自Hep3B、PLC、MCF7、HEK293T、Hela和U2OS中的任意一种。
9.权利要求1～8任意一项所述的方法在酵母细胞与动物细胞融合中的应用。
10.权利要求1～8任意一项所述的方法在基因合成、基因递送中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种染色体跨物种高效转移的方法，其特征在于，包括以下步骤：酵母细胞采用酵母溶壁酶消化得到酵母细胞原生质体，酵母细胞原生质体和动物细胞共孵育培养，共孵育培养时加入凋亡抑制剂z-vad-fmk或坏死抑制剂necrostatin-1；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凋亡抑制剂z-vad-fmk的工作浓度为10～40μm；所述坏死抑制剂necrostatin-1的工作浓度为100～400μm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化时间为10～60min，所述酵母溶壁酶的工作浓度为60～300u/ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在共孵育培养前，所述酵母细胞原生质体加入抗真菌药培养；所述抗真菌药为0～25ng/μl的卡泊芬净+0～25...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙强，牛祖彪，周文昭，郑幽，姜承祚，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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