【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种预测新兴镰刀菌毒素和传统镰刀菌毒素多元联合毒性相互作用的方法，属于联合毒性研究。
技术介绍
1、真菌毒素是典型的微生物毒素，是真菌生长过程中产生的次生代谢产物。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)作为一种传统镰刀菌毒素，存在十分广泛，在世界各地的粮食和饲料中作为常见污染物被普遍发现。近年来，以恩镰孢菌素(enns)为代表的新兴真菌毒素被越来越多的报道，它们不仅种类增加快，而且与传统真菌毒素存在联合污染，由于毒理数据较少，对动植物体的风险也尚不明确。
2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)和恩镰孢菌素(enns)均属于镰刀菌毒素，两种毒素共同暴露的风险极高。因此，对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)和恩镰孢菌素(enns)联合毒性的研究对于保障食品安全并推动危害物限量标准制订具有重要的指导作用。
3、目前关于联合毒性的研究大多聚焦于二元混合物，三元及以上的混合物的研究很少，关于新兴毒素的联合毒性研究更为少见。当混合物组成种类增多时，很容易超过每种毒素的毒效应阈值，因此越来越多的毒素研究致力于其综合毒性，特别是探索毒理学相互作用的类型。
4、现有技术常用的混合物毒性研究方法，如等毒性法、固定浓度法等，只能针对一种或几种特定混合物，当混合物组分增多时，各组分浓度及比例就会成指数级增长，不仅很难模拟实际环境中有害物质混合体系多样的浓度变化还会大大增加实验成本。
5、传统的模式生物毒性评价方法存在一些局限性，如代谢和遗传差异显著、动物实验的伦理争议、测试周期较长以及成本高昂等。
>技术实现思路
1、针对现有技术存在的缺陷与不足，本专利技术的目的是提供了一种新兴镰刀菌毒素恩镰孢菌素(enns)和传统镰刀菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)对肝细胞hepg2的联合毒性作用的方法，可以更客观、全面地预测真菌毒素复杂暴露情况下对人体健康的潜在威胁。
2、为了实现上述目的，提供的技术方案如下：
3、本专利技术提供了一种预测新兴镰刀菌毒素与传统镰刀菌毒素联合毒性相互作用的方法，包括如下步骤：
4、(1)采用均匀设计射线法(ud-ray)设计新兴镰刀菌毒素与传统镰刀菌毒素多元混合体系；并将毒素按设计配比均匀混合并稀释成一系列浓度梯度的毒素工作液；
5、(2)获取对数生长期hepg2细胞，接种培养；用步骤(1)的毒素工作液孵育hepg2细胞，于培养箱中继续培养；之后采用cck-8试剂法测定毒素工作液对hepg2细胞的活性抑制率；
6、(3)采用两参数非线性函数对浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合，获得实验观测曲线；用三种经典联合毒性评价模型计算多元毒素混合联合作用效果，并绘制模型预测曲线；通过比较实验观测曲线和模型预测曲线间的偏差来判断物质间的相互作用类型，当模型预测曲线位于实验观测曲线95％置信区间(oci)以上、区间内或以下时，则认为混合物各组分之间发生了拮抗、加和或协同作用。
7、在一种实施方式中，所述新兴镰刀菌毒素为镰孢菌素a(ena)、恩镰孢菌素a1(ena1)、恩镰孢菌素b(enb)和恩镰孢菌素b1(enb1)。
8、在一种实施方式中，所述传统镰刀菌毒素为脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)。
9、在一种实施方式中，步骤(1)所述的均匀设计射线法(ud-ray)为设计四种恩镰孢菌素(enns)与脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)多元混合体系组成射线，使用的ud表示u6(65)，其中6为浓度效应值数量，下标6为实验次数，即射线数量，包括ud-1、ud-2、ud-3、ud-4、ud-5和ud-6六条射线；上标5为毒素数量。
10、在一种实施方式中，所述浓度效应值指毒素对细胞活性抑制率，分别设置为5％、10％、15％、20％、30％和50％时的浓度效应值。
11、在一种实施方式中，步骤(2)所述的hepg2细胞接种密度为10000-60000个/孔。
12、在一种实施方式中，步骤(2)所述的毒素工作液孵育hepg2细胞的时间为24-72h。
13、在一种实施方式中，步骤(2)所述cck-8试剂法具体为：hepg2细胞经毒素工作液孵育后，加入cck-8试剂(10％，v/v)，再次置于恒温培养箱中避光培养1-2h后，置于多功能酶标仪中检测每孔于450nm处的吸光度值。
14、cck-8试剂中含有-8[其化学名称为：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲染料，生成的甲物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
15、在一种实施方式中，步骤(3)所述两参数非线性函数是指logit函数和weibull函数。
16、在一种实施方式中，步骤(3)所述浓度-效应数据是指梯度毒素工作液浓度与其对应的细胞活性抑制率的数据。
17、在一种实施方式中，步骤(3)所述非线性最小二乘拟合基于origin软件的函数拟合，通过比较关系系数(relationship coefficient，r)和均方根误差(root mean squareerror，rmse)来筛选拟合效果最好的函数，即r值越高或rmse值越低，则拟合效果越好。
18、在一种实施方式中，步骤(3)所述的三种经典联合毒性评价模型指浓度加和(ca)模型、独立作用(ia)模型和两阶段预测(tsp)模型。
19、与现有技术相比，本专利技术的优点在于：
20、(1)本专利技术的方法高效且精确，通过单一毒素实验和联合毒性实验，检测不同暴露模式下的毒效应；采用均匀设计射线(ud-ray)的方法设计由有真菌毒素组成的多元混合物，能够用尽量少的实验次数充分模拟复杂的环境暴露情况；选择三种不同的模型来评估混合物的毒性作用，为真菌毒素联合效应的判断提供可靠预测；
21、(2)本专利技术的方法实用性强，适用于多种模式细胞的毒效应检测，可重复性强，可同时检测不同物质不同比例的混合物的毒性，为环境中真菌毒素混合物的风险评估提供了可靠的技术手段。
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1.一种预测新兴镰刀菌毒素与传统镰刀菌毒素联合毒性相互作用的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述新兴镰刀菌毒素为镰孢菌素A、恩镰孢菌素A1、恩镰孢菌素B和恩镰孢菌素B1；所述传统镰刀菌毒素为脱氧雪腐镰刀菌烯醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的均匀设计射线法为设计四种恩镰孢菌素与脱氧雪腐镰刀菌烯醇五元混合体系组成射线，使用的UD表示U6(65)，其中6为浓度效应值数量，下标6为实验次数，即射线数量，包括UD-1、UD-2、UD-3、UD-4、UD-5和UD-6六条射线；上标5为毒素数量。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浓度效应值指毒素对细胞活性抑制率，分别设置为5％、10％、15％、20％、30％和50％时的浓度效应值。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的HepG2细胞接种密度为10000-60000个/孔。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述CCK-8试剂法具体为：HepG2细胞经毒素工作
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述两参数非线性函数是指Logit函数和Weibull函数。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述浓度-效应数据是指梯度毒素工作液浓度与其对应的细胞活性抑制率的数据。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述非线性最小二乘拟合基于Origin软件的函数拟合，通过比较关系系数R和均方根误差RMSE来筛选拟合效果最好的函数，即R值越高或RMSE值越低，则拟合效果越好。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的三种经典联合毒性评价模型指浓度加和模型、独立作用模型和两阶段预测模型。
...【技术特征摘要】
1.一种预测新兴镰刀菌毒素与传统镰刀菌毒素联合毒性相互作用的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述新兴镰刀菌毒素为镰孢菌素a、恩镰孢菌素a1、恩镰孢菌素b和恩镰孢菌素b1；所述传统镰刀菌毒素为脱氧雪腐镰刀菌烯醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的均匀设计射线法为设计四种恩镰孢菌素与脱氧雪腐镰刀菌烯醇五元混合体系组成射线，使用的ud表示u6(65)，其中6为浓度效应值数量，下标6为实验次数，即射线数量，包括ud-1、ud-2、ud-3、ud-4、ud-5和ud-6六条射线；上标5为毒素数量。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浓度效应值指毒素对细胞活性抑制率，分别设置为5％、10％、15％、20％、30％和50％时的浓度效应值。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的hepg2细胞接种密度为10000-60000个/孔。...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙秀兰，汤璐瑶，叶永丽，纪剑，叶金，张银志，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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