【技术实现步骤摘要】
本申请属于微生物检测，具体涉及检测苹果黑星病菌的组合物及其应用。
技术介绍
1、苹果黑星病菌学名venturia inaequalis(cooke)g.winter，隶属于真菌界fungi，子囊菌门ascomycota，盘菌亚门pezizomycotina，座囊菌纲dothideomycetes，格孢菌亚纲pleosporomycetidae，黑星菌目venturiales，黑星菌科venturiaceae，黑星菌属venturia。
2、早在1600年意大利画家卡拉瓦桥壁画作品中，就已可以看见苹果上携带有苹果黑星病菌，证明苹果黑星病菌的发生已具有几个世纪的历史。瑞典植物学家elias fries最先描述了苹果黑星病菌的无性阶段，随后苹果黑星病菌在梨属上首次被命名为spilocaeapomi。根据国际植物学命名规则，苹果黑星病菌的无性态最终被命名为spilocaea pomifr.。该病菌的无性阶段属于无性阶段属于半知菌亚门(deuteromycotina)丝孢纲(hyphomycetes)丝孢目(hyphomycetales)。1866年cooke发现了苹果黑星病菌的有性阶段，但当时尚未确认该病原菌的无性阶段和有性阶段属于同一种真菌。直到1887年goethe将其无性阶段和有性阶段结合起来，最终确认该病菌为苹果黑星病菌。cooke将苹果黑星病菌的有性阶段命名为sphaerella inaequalis。1897年aderhold将其有性阶段更名为venturiainaequalis。
3、苹果黑星病菌在
4、苹果黑星病菌主要寄主为苹果属果树。苹果黑星病菌的感染症状一般在当年即可发现，病变见于叶片、叶柄、萼片、花、果实和新芽和芽鳞上，最严重的症状出现于叶片和果实上。当其在春季感染苹果叶片时，会出现深绿色天鹅绒状斑点，通常出现在叶片的下表皮，随时间发展会出现圆形病斑，颜色从橄榄色到棕色不等，主要出现叶片的上表皮，受感染部位体积增大，叶片裂开。发生后期斑点可能会散生黑色小点，这些是苹果黑星病菌的分生孢子梗以及分生孢子盘，其分生孢子借助风雨进行传播。当幼嫩叶片受害比较严重时，会出现叶片变小、增厚，受感染的组织折叠并被扭曲。叶片上有许多病斑出现时，可能会出现脱落现象。苹果黑星病菌感染苹果果实幼体时，由于病变下的愈伤组织不能继续扩张，导致果实开裂。随果实逐渐成熟，发病部位中心会出现坏死，并且带有松散的角质层晕圈。如果是在果实成熟晚期发生感染，由于发生缓慢，症状较小或不明显，表现为有黑点扩张，形成结痂斑块。这些病班会影响苹果的品质和产量，降低商品价值。
5、迄今为止，国内外已经建立了一些苹果黑星病菌的快速检测方法。如现行国家标准gbt 28097-2011苹果黑星病菌检疫鉴定方法，其主要通过对待检植株分离和对分离菌株进行形态学观察，从而对苹果黑星病菌进行鉴定。形态学观察的方法对实验人员有较高的要求，且费时费力，降低了口岸通关效率。普通pcr检测方法需要进行跑胶等后续处理，操作较为繁琐，耗时较长，对于亲缘关系较近的种类如苹果黑星病菌及其近似种无法实现一步区分，且对检测人员专业素质要求较高，难以满足快速、准确、灵敏鉴定的检测要求。
技术实现思路
1、本申请要解决技术问题是：如何快速地检测或者鉴定苹果黑星病菌。
2、为解决上述技术问题，本申请提供一种特异扩增苹果黑星病菌(拉丁学名为venturia inaequalis)的组合物，所述组合物包括特异扩增苹果黑星病菌特异dna片段的引物对，所述特异dna片段的核苷酸序列是seq id no:1第125-186位。
3、进一步地，所述的组合物中，所述引物对由引物vi125f和引物vi125r组成，所述引物vi125f为核苷酸序列是seq id no:2的单链dna分子；所述引物vi125r为核苷酸序列是seq id no:3的单链dna分子。
4、进一步地，所述组合物还包括与所述目的片段特异性结合的探针，所述探针的核苷酸序列是seq id no:4。
5、进一步地，所述的组合物中，所述探针为dna探针，所述dna探针的5’端标记报告基团，3’端标记猝灭基团。
6、所述荧光基团标记在探针的5’末端。
7、所述猝灭基团标记在探针的3’末端。
8、所述荧光基团选自fam、6-fam、vic、hex、trt、cy3、cy5、rox、joe、fitc、tet、ned、tamra、lc red640、lc red705、quasar705或texas red中的至少一种。
9、所述猝灭基团选自tamra、bhq1、bhq2、bhq3、mgb和dabcy1中至少一种。
10、进一步地，所述的组合物中，所述探针的报告基团为fam。
11、所述fam全称为羧基荧光素，所述羧基荧光素可选自5-羧基荧光素(5-fam)或5-羧基荧光素(6-fam)。
12、所述5-羧基荧光素为cas no.76823-03-5的化合物。
13、所述6-羧基荧光素为cas no.3301-79-9的化合物。
14、进一步地，所述的组合物中，所述探针的猝灭基团为mgb。
15、进一步地，该组合物可用于检测微生物、微生物纯培养物、来自蔷薇科植物的样品或相关的环境样品(例如包装、土壤等)。
16、进一步地，所述样品含有或可能含有苹果黑星病菌。
17、进一步地，所述样品可为微生物、微生物纯培养物、来自蔷薇科植物的器官或组织或相关的环境样品(例如包装、土壤等)。
18、进一步地，所述蔷薇科植物的器官或组织可为蔷薇科植物的叶片、叶柄、萼片、花、果实和新芽和芽鳞。
19、进一步地，所述蔷薇科植物的器官或组织可为叶片或果实。
20、进一步地，所述蔷薇科植物包括但不限于苹果树或梨树。
21、本申请还提供所述的组合物在在下述b1)-b6)中的应用：
22、b1)在检测苹果黑星病菌中的应用；
23、b2)在制备用于检测苹果黑星病菌的产品中的应用；
24、b3)在鉴定或辅助鉴定苹果黑星病菌中的应用；
25、b4)在制备用于鉴定或辅助鉴定苹果黑星病菌的产品中的应用；
26、b5)在鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或含有苹果黑星病菌中的应用；
27、b6)在制备用于鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或含有苹果黑星病菌的产品中的应用。
28、进一步地，所述的应用中，所述产品可为试剂和/或试剂盒。
29、本申请还提供用于检测苹果黑星病菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述的组合物。
30、进一步地，所述的试剂盒中，所述引物vi125f、引物vi125r和探针的物质的量的比值为6:6:5。
31、可选地，所述述试剂盒还含有实时本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特异扩增苹果黑星病菌的组合物，所述组合物包括特异扩增苹果黑星病菌特异DNA片段的引物对，所述苹果黑星病菌特异DNA片段的核苷酸序列是SEQ ID NO:1第125-186位。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述引物对由引物VI125F和引物VI125R组成，所述引物VI125F为核苷酸序列是SEQ ID NO:2的单链DNA分子；所述引物VI125R为核苷酸序列是SEQ ID NO:3的单链DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：所述组合物还包括与所述目的片段特异性结合的探针，所述探针的核苷酸序列是SEQ ID NO:4。
4.权利要求1-3任一项所述的组合物在下述B1)-B6)中的应用：
5.用于检测苹果黑星病菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中，所述引物VI125F、引物VI125R和探针的物质的量的比值为6:6:5。
7.权利要求5或6所述试剂盒在下述任一项中的应用：
8.一种苹果黑星病菌的检测方法，其特征在于：包括以待测样品的DNA为模板，采用权利要求1-3任一项所述的组合物或权利要求5或6所述的试剂盒进行实时荧光PCR并检测荧光信号，根据所述荧光信号判断待测样品是否有或候选有苹果黑星病菌。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述根据所述荧光信号判断待测样品是否有或候选有苹果黑星病菌为：当所述荧光信号出现特异性扩增曲线且特异性扩增超过阈值线，则表明所述待测样品有或候选有苹果黑星病菌；当所述荧光信号没出现阳性扩增曲线或特异性扩增没超过阈值线，则表明所述待测样品无或候选无苹果黑星病菌。
10.一种苹果黑星病菌的检测方法，其特征在于：包括以待测样品的DNA为模板，采用权利要求1-3任一项所述组合物或权利要求5或6所述试剂盒中的引物VI125F和引物VI125R进行PCR，然后按照如下确定所述待测样品中是否含有苹果黑星病菌：
...【技术特征摘要】
1.一种特异扩增苹果黑星病菌的组合物，所述组合物包括特异扩增苹果黑星病菌特异dna片段的引物对，所述苹果黑星病菌特异dna片段的核苷酸序列是seq id no:1第125-186位。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述引物对由引物vi125f和引物vi125r组成，所述引物vi125f为核苷酸序列是seq id no:2的单链dna分子；所述引物vi125r为核苷酸序列是seq id no:3的单链dna分子。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：所述组合物还包括与所述目的片段特异性结合的探针，所述探针的核苷酸序列是seq id no:4。
4.权利要求1-3任一项所述的组合物在下述b1)-b6)中的应用：
5.用于检测苹果黑星病菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中，所述引物vi125f、引物vi125r和探针的物...
【专利技术属性】
技术研发人员：段维军，郭立新，李雪莲，黄素文，赵雷，王佳莹，
申请(专利权)人：宁波检验检疫科学技术研究院宁波国检贸易便利化服务中心，
类型：发明
国别省市：
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