【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具的制备和应用。
技术介绍
1、人脑是自然界中最为复杂的系统之一，而神经网络是大脑行使功能的基础。神经网络的正常连接使得人体产生正常的生理活动，如认知、学习、记忆和恐惧等；神经网络的异常往往导致神经疾病的出现，如：阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症等，但是还没有有效的手段来治疗这些神经疾病。目前，正常生理活动和致病机制均不清楚，主要的原因在于脑神经网络连接信息的缺乏。因此，开展脑神经环路的研究而绘制高精度的脑功能连接图谱，对于了解人的生理活动和致病机制具有重要的意义。我国政府高度重视脑科学的研究，《国家中长期科学和技术发展规划》将“脑科学与认知科学”列为八大前沿科学问题之一，有一批科学家已投身于该领域的研究，并取得了一系列的成果。2012年，中国科学院启动了战略性先导科技专项“脑功能联结图谱研究”，并在2014年成立了“脑科学卓越创新中心”。2013年，美国和欧盟已经开始实施人脑图谱研究计划。脑科学研究计划是继人类基因组计划后又一个具有挑战的伟大计划，该计划的研究成果将会和人类基因组计划的成果一样造福人类。性能优良的神经环路示踪工具对于顺利开展该项目具有十分重要的作用。
2、狂犬病毒属于弹状病毒科(rhabdoviridae)狂犬病毒属(lyssavirus)成员，能感染神经细胞，并在神经网络中运输；其基因组为负链rna，长度约为12kb，编码五个蛋白，分别为n、p、m、g和l，其中g蛋白作为外膜蛋白，包装成完整的病毒颗粒，但是其对病毒的复
技术实现思路
1、针对现有技术中的缺点和不足，本专利技术的目的在于提供一种减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具的制备和应用。本专利技术首先对狂犬病毒n基因序列进行重排并修饰得到一种新型狂犬病毒n基因，命名为optin基因，optin基因可以降低狂犬病毒毒性，同时能够提高狂犬病毒逆向跨单突触效率，其序列如seq id no.2所示，然后制备表达该新型狂犬病毒n基因的重组狂犬病毒。
2、本专利技术第一方面提供一种减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具的制备方法，包括以下步骤：
3、(1)构建克隆：采用asci和sacii酶切psaddeltag-f3载体，采用同源重组的方式将seq id no.1所示序列插入到载体中，获得克隆命名为sad-mruby3；然后采用swai和clai酶切sad-mruby3质粒，采用同源重组的方式将seq id no.2所示序列插入到该质粒，获得克隆命名为attsad-mruby3；
4、(2)构建重组狂犬病毒：将步骤(1)所得质粒attsad-mruby3、辅助质粒pn、pp、pg和pl混合转染b7gg细胞后感染enva细胞，收集细胞培养基上清，纯化后即获得减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具。
5、本专利技术第二方面提供由上述制备方法制备得到的减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具。
6、本专利技术第三方面提供上述减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具在对哺乳动物的脑神经环路进行示踪中的应用。
7、本专利技术第四方面提供上述减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具在研究药物抑制狂犬病毒作用机制中的应用。
8、本专利技术第五方面提供上述减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具在狂犬病毒病毒疫苗的开发中的应用。
9、本专利技术第六方面提供上述减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具在狂犬病毒感染的动物模型的建立中的应用。
10、本专利技术第七方面提供上述减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具在狂犬病毒病毒复制和致病机制的分析中的应用。
11、本专利技术第八方面提供上述减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具在建立狂犬病毒的药物筛选平台中的应用。
12、由于采用以上技术方案，本专利技术的有益效果在于：
13、(1)解析神经环路结构是开展脑科学研究的基础，良好的用于神经环路标记的工具对于解析神经环路的结构具有重要意义。本专利技术对狂犬病毒n基因序列进行重排并修饰后得到的optin基因，optin基因可以降低狂犬病毒毒性，同时能够提高狂犬病毒逆向跨单突触效率，其能作为神经环路标记工具，便于开展相关的研究。
14、(2)本专利技术基于optin基因制备了一种减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具，其毒性低且能更好帮助狂犬病毒逆向跨突触，便于开展相关的研究。
15、(3)本专利技术对于开展狂犬病毒的基础性研究(如致病机制、复制机制等)和应用性研究(如神经环路标记、细胞基因治疗、溶瘤病毒、新型疫苗和诊断试剂等)具有重要的现实意义和广泛的应用价值。
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1.一种减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.权利要求1所述制备方法制备得到的减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具。
3.权利要求2所述减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具在对哺乳动物的脑神经环路进行示踪中的应用。
4.权利要求2所述减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具在研究药物抑制狂犬病毒作用机制中的应用。
5.权利要求2所述减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具在狂犬病毒病毒疫苗的开发中的应用。
6.权利要求2所述减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具在狂犬病毒感染的动物模型的建立中的应用。
7.权利要求2所述减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具在狂犬病毒病毒复制和致病机制的分析中的应用。
8.权利要求2所述减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具在建立狂犬病毒的药物筛选平台中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.权利要求1所述制备方法制备得到的减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具。
3.权利要求2所述减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具在对哺乳动物的脑神经环路进行示踪中的应用。
4.权利要求2所述减毒表达红色荧光蛋白的高效逆向跨突触狂犬病毒示踪工具在研究药物抑制狂犬病毒作用机制中的应用。
5.权...
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