【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白分离纯化，具体涉及一种从蛇毒中纯化降纤酶的方法。
技术介绍
1、降纤酶作为蛇毒出血毒素中的一类类凝血酶(thrombin-like enzyme简称tle)是被研究的最多且是在临床应用上最为成熟的蛇毒类生化药品。
2、降纤酶是从长白山白眉蝮蛇蛇毒中提取的蛋白水解酶[《国家药品标准-降纤酶》(wsi-xg-031-2000)]，是一种类凝血酶(tle)类蛋白水解酶，是糖蛋白，同时具有精氨酸酯酶及类凝血酶的活性。降纤酶是特定蛇毒当中提取的一种蛋白酶，它有溶栓、抗栓、降黏、降纤等明确的药理作用，广泛应用于各种栓塞性疾病比如脑血栓、短暂性脑缺血发作、心肌梗死、股动脉栓塞、血栓闭塞性脉管炎、肺栓塞等降纤酶的抗凝血作用主要是直接作用于血浆纤维蛋白原，对体内其他凝血因子如ii、vi、vi x等无明显影响，因此降纤酶不容易引起出血。降纤酶还有类似胰蛋白酶的纤容酶活性，能促进组织纤溶酶原激活剂从血管内皮释放，提高人血浆中的组织型纤溶酶原激活剂(t-pa)和尿激酶(urokinase)活性，共同参与激活存在于血凝块和血浆中的纤溶酶原，使其变为纤溶酶。因此，降纤酶具有抵抗血凝、溶解血栓、去纤、降低血粘度和打张血管改善微循环、清除自由基等功效(汤圣希，1999)。
3、目前，公开的降纤酶的制备方法较多，如《尖吻蝮蛇蛇毒降纤酶的分离纯化及其经直肠给药的实验研究》中，记载了利用benzamidine bestarose 4ff亲和层析和spehadexg-75分子筛层析结合实现对尖吻蝮蛇蛇毒降纤酶的分离纯化；或《白
4、现有的制备方法为了实现高纯度蛇毒降纤酶的纯化，往往需要通过亲和层析进行纯化，利用亲和层析的高特异性，实现对降纤酶的纯化，但是亲和层析的成本较高，不利于大规模的工业生产。因此本专利技术开发了一种利用离子层析技术得到高纯度降纤酶的纯化工艺方法。
技术实现思路
1、本专利技术主要目的在于提供一种利用离子层析技术从蛇毒中提取高纯度降纤酶的方法，以解决目前降纤酶提取纯化中主要使用亲和层析成本过高的问题。利用本专利技术公开的纯化方法，利用阴离子层析和离子型混合模式层析能够纯化得到高纯度的降纤酶目标蛋白。
2、本专利技术第一个方面公开了一种从蛇毒中纯化降纤酶的方法，所述方法包括如下步骤：
3、s1：将蛇毒粗品用平衡缓冲液溶解后，过滤除沉淀得澄清液；
4、s2：用所述平衡缓冲液平衡阴离子层析柱后，将s1获得的所述澄清液上柱，用洗脱液对其洗脱，收集含降纤酶目标蛋白的洗脱成分；
5、s3：用低ph磷酸盐缓冲液平衡离子型混合模式层析柱后，将s2得到的洗脱成分在电导处理后上柱，用高ph磷酸盐缓冲液对其洗脱，收集降纤酶目标蛋白洗脱成分，得到纯品的降纤酶；
6、其中，所述低ph磷酸盐缓冲液的ph值为6.5-7.5，所述高ph磷酸盐缓冲液的ph值为8.5-9.5；
7、其中，s2中所用阴离子层析柱中固定相为deae purose 6hp；s3中离子型混合模式层析柱中所使用的固定相为rigose mmc hires。
8、优选地，s3中，所述电导处理为：将s2得到的含降纤酶目标蛋白的洗脱成分的电导率调整到2-4ms/cm，ph调整到6.5-7.5。
9、优选地，s3中，所述高ph磷酸盐缓冲液为含nacl的高ph磷酸盐缓冲液，nacl的浓度为0.25-0.35mol/l。
10、优选地，s3中，所述高ph磷酸盐缓冲液的ph值为9，nacl的浓度为0.3mol/l。
11、优选地，s1和s2中所述平衡缓冲液为ph值7-8的磷酸盐缓冲液；
12、s2中所述洗脱液为含nacl的磷酸盐缓冲液，ph值为7-8，nacl的浓度为0.1-0.3mol/l。
13、优选地，s3中，将s2得到的洗脱成分，在电导处理后经0.45μm滤膜过滤后上柱。
14、优选的，s1中，将溶解后获得的样品溶液的电导率和ph值调整至与所述平衡缓冲液一致，再经0.45μm滤膜过滤获得所述澄清液。
15、本专利技术第二个方面公开了一种高纯度的蛇毒降纤酶，由上述方法制得，所述蛇毒降纤酶的分子量为31-41kda。
16、相较于现有技术，本专利技术有益效果在于：
17、本专利技术采用了不同原理的层析分离，选用了rigose mmc hires层析介质的特定离子型混合模式层析，配合第一步的阴离子层析，通过对ph，缓冲液等参数条件进行设计和调整，只需要经过两步层析就能够达到高纯度的结果，在灰度分析下，纯化样品的纯度显著高于现有技术水平。
18、其中，在纯化过程中，蛇毒粗品先用平衡缓冲液溶解，其作用在于，一方面平衡缓冲液能够提供一个稳定的环境，避免突然的ph值变化，对蛋白质的折叠状态、溶解性和活性造成不可逆的影响；另一方面平衡缓冲液可以减少样品中杂质的吸附，简化后续的纯化流程，提升纯化后蛋白的纯度。
19、在第一步阴离子层析中，通过蛇毒中不同蛋白质与离子交换树脂上电荷基团可逆结合力的差异，实现不同蛋白质的初步分离。在本专利技术中，通过对磷酸盐缓冲液和盐浓度等参数的调节，进一步优化蛇毒中不同蛋白质在阴离子层析柱中的分离效果。
20、本专利技术选用的rigose mmc hires层析介质是对功能配基的结构进行优化设计，组合阳离子和疏水相互作用模式，加强对目标蛋白的亲和性和选择性，从而提高纯化效率。
21、本专利技术开发的纯化方法复合了阴离子层析和离子型混合模式层析，实现了高纯度降纤酶的分离纯化，成本低、操作便捷，适合大规模推广。
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1.一种从蛇毒中纯化降纤酶的方法，其特征在于，所述方法是从蛇毒中纯化降纤酶，其包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种从蛇毒中纯化降纤酶的方法，其特征在于，S3中，所述电导处理为：将S2得到的含降纤酶目标蛋白的洗脱成分的电导率调整到2-4mS/cm，pH调整到6.5-7.5。
3.根据权利要求1所述的一种从蛇毒中纯化降纤酶的方法，其特征在于，S3中，所述高pH磷酸盐缓冲液为含NaCl的高pH磷酸盐缓冲液，NaCl的浓度为0.25-0.35mol/L。
4.根据权利要求3所述的一种从蛇毒中纯化降纤酶的方法，其特征在于，S3中，所述高pH磷酸盐缓冲液的pH值为9，NaCl的浓度为0.3mol/L。
5.根据权利要求1所述的一种从蛇毒中纯化降纤酶的方法，其特征在于，S1和S2中所述平衡缓冲液为pH值7-8的磷酸盐缓冲液；
6.根据权利要求1所述的一种从蛇毒中纯化降纤酶的方法，其特征在于，S3中，将S2得到的洗脱成分，在电导处理后经0.45μm滤膜过滤后上柱。
7.根据权利要求1所述的一种从蛇毒中纯化降纤酶的方法
8.一种高纯度的蛇毒降纤酶，其特征在于，所述蛇毒降纤酶由权利要求1-7中任意一项所述的方法制得，所述蛇毒降纤酶的分子量为31-41kDa。
...【技术特征摘要】
1.一种从蛇毒中纯化降纤酶的方法，其特征在于，所述方法是从蛇毒中纯化降纤酶，其包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种从蛇毒中纯化降纤酶的方法，其特征在于，s3中，所述电导处理为：将s2得到的含降纤酶目标蛋白的洗脱成分的电导率调整到2-4ms/cm，ph调整到6.5-7.5。
3.根据权利要求1所述的一种从蛇毒中纯化降纤酶的方法，其特征在于，s3中，所述高ph磷酸盐缓冲液为含nacl的高ph磷酸盐缓冲液，nacl的浓度为0.25-0.35mol/l。
4.根据权利要求3所述的一种从蛇毒中纯化降纤酶的方法，其特征在于，s3中，所述高ph磷酸盐缓冲液的ph值为9，nacl的浓度为0.3mol/l...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏海锋，许瑞琪，朱贺文，王珍珠，
申请(专利权)人：东富龙千纯生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
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