【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其涉及一种甲基转移酶突变体高通量筛选方法、甲基转移酶突变体及应用。
技术介绍
1、甲基化是将甲基(-ch3)从一种化合物转移到另一种化合物的过程，通常也使得物质的生物活性和生物利用度发生重大改变。目前，基于化学方法的甲基化会使用有毒试剂，并产生有毒废弃物，且不具备区域选择性。与之相比，酶甲基化具有极高的特异性，对环境友好，使用起来更为安全。甲基化酶也被称为甲基转移酶，是一类具有广泛生物学功能的大家族，通常以sam(s-腺苷甲硫氨酸)作为甲基化供体。其在脂类、蛋白质、多糖或核苷酸的甲基化反应中起重要作用，这些修饰产生了多种重要的生物学功能，如表观遗传现象和生成众多次生代谢物。其中，氧-甲基转移酶被应用于阿魏酸、樱花素、鼠李素、褪黑素、香草醛和紫檀芪等天然产物的生物合成，具有极高的生物经济价值。
2、对甲基转移酶进行合理改造，以实现酶活性、选择性的增强，进而提高目标物的生产效率，是一种常见策略。然而，目前还没有一种通用、便捷的分析方法来快速检测甲基转移酶活性进行甲基转移酶改造的评估及筛选。大多数甲基转移酶活性测定都是基于放射性标记或荧光检测，检测过程费时费力，且对仪器设备具有较高要求。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种甲基转移酶突变体高通量筛选方法、甲基转移酶突变体及应用。本专利技术能够用于甲基转移酶突变体的高通量筛选，提高甲基转移酶改造效率，获得高活性的甲基转移酶突变体；本专利技术提供的甲基转移酶突变体能显著
2、为解决上述技术问题，本专利技术采用了以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种甲基转移酶突变体的高通量筛选方法，包括以下步骤：
4、(a)将甲基转移酶突变体文库中的单克隆活化、培养，诱导表达；
5、(b)向步骤(a)的体系中加入底物，以sam为甲基化供体催化底物进行甲基转移酶催化反应；
6、(c)破碎细胞，加入巯基检测试剂，巯基检测试剂与体系中甲基化供体sam催化甲基化反应中产生的巯基化合物反应，生成有色产物，测定吸光度值，基于吸光值的高低筛选甲基转移酶突变体，吸光值高，预测对应的甲基转移酶突变体的活性高。
7、按上述方案，甲基转移酶催化反应以sam为甲基化供体，反应结束后sam被转化为sah，又经mtn-luxs连续两步催化形成带有巯基(-sh)的同型半胱氨酸(hcys)，基于巯基检测试剂与巯基化合物带有巯基(-sh)的同型半胱氨酸(hcys)的特征显色反应，测定体系的吸光度值，基于吸光值的高低筛选甲基转移酶突变体。
8、按上述方案，所述的巯基检测试剂为dtnb试剂，利用dtnb与体系中甲基化供体sam催化甲基化反应中产生的巯基化合物的特征显色反应进行吸光度值测定。
9、按上述方案，以构建质粒的载体和甲基转移化酶基因为模板，扩增得到线性化载体和甲基转移化酶基因片段，将甲基转移化酶基因片段与线性化载体连接，得到重组质粒，以重组质粒为模板，设计引物进行质粒扩增诱变，获得碱基突变的线性化质粒载体，再将其转化至大肠杆菌，构建甲基转移酶突变体文库。
10、按上述方案，上述重组质粒中还含有metk、mtn、luxs基因片段，腺苷甲硫氨酸合成酶(metk)基因催化甲硫氨酸(met)和atp反应生成sam(s-腺苷甲硫氨酸)，作为甲基化供体使用，催化底物进行甲基化反应反应结束后sam被转化为sah，又经mtn-luxs连续两步催化形成带有巯基(-sh)的同型半胱氨酸(hcys)。
11、按上述方案，选取吸光值占前8-12％的单克隆进行测序，筛选获得甲基转移酶突变体。优选吸光值占前8-12％的单克隆进行测序，可以实现快速筛选并保证更好的筛选效果。进一步地，再测定经上述筛选测序得到的甲基转移酶突变体用于催化底物甲基转移酶催化甲基化反应的活性，根据反应活性高低，进一步筛选出活性高的甲基转移酶突变体。
12、按上述方案，步骤(a)中活化、培养使用的多孔板为24孔板、48孔板、96孔板或384孔板；优选地，所述多孔板为96孔板。
13、按上述方案，所述活化、培养条件为：温度25～37℃、震荡摇床转速300～1000rpm、培养时间6～20h。
14、按上述方案，步骤(a)中，所述的诱导表达为加入iptg诱导蛋白表达，所述诱导剂浓度为0.05～2mm，诱导温度为18～30℃。
15、按上述方案，所述巯基检测试剂浓度为0.01～5mm，进一步地为0.05-1mm。
16、按上述方案，所述破碎方法为溶菌酶反应、液氮速冻、酸碱处理、表面活性剂处理、超声处理和石英砂震荡研磨；优选地，为溶菌酶反应。
17、按上述方案，甲基转移酶突变体的高通量筛选方法中，以n-乙酰5-羟基色胺为底物，进行甲基转移酶催化反应合成n乙酰-5-甲氧基色胺。
18、按上述方案，n-乙酰5-羟基色胺底物浓度为0.1～10g/l、反应ph为5.0～9.0、催化反应温度为20～40℃。
19、第二方面，本专利技术以底物n-乙酰5-羟基色胺为例，提供了一种甲基转移酶突变体高通量筛选方法在以n-乙酰5-羟基色胺为底物甲基转移酶催化反应合成n乙酰-5-甲氧基色胺的甲基转移酶突变体的筛选中的应用。
20、第三方面，本专利技术提供一种甲基转移酶突变体，为以下任一项所示的氨基酸序列：
21、(a)其氨基酸序列由seq id no:2所示序列在选自下组的一个或多个氨基酸残基位点发生突变得到：128位、160位、321位、322位和324位，即上述位点可以选自除原本氨基酸外的其他氨基酸中的任意一种；
22、或(b)所述甲基转移酶与(a)所述的氨基酸序列相似性达90％以上，优选95％以上，更优选99％以上，并且具有(a)所述蛋白的功能，其中对应于seq id no:2所示氨基酸序列的128位、160位、321位、322位和324位氨基酸与(a)所述的氨基酸序列突变方式相同；
23、或(c)所述甲基转移酶由在(a)所述的氨基酸序列的c末端和/或n末端添加多个氨基酸或缺失1-20个，优选1-10个，更优选1-5个的氨基酸而形成，并且具有(a)所述蛋白的功能，其中对应于seq id no:2所示氨基酸序列的128位、160位、321位、322位和324位氨基酸与(a)所述的氨基酸序列突变方式相同。具体地，添加的氨基酸序列可以为1-20个，优选1-10个，更优选1-5个的氨基酸，也可为蛋白标签序列如his、flag、mbp、sumo、gst、trx。
24、优选地，128位的突变是突变为亮氨酸，160位的突变是突变为丝氨酸或缬氨酸，321位的突变是突变为亮氨酸，322位的突变是突变为亮氨酸或苯丙氨酸，324位的突变是突变为天冬氨酸。
25、第四方面，本专利技术还提供一种编码上述甲基转移酶突变体的基因。...
【技术保护点】
1.一种甲基转移酶突变体的高通量筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于：甲基转移酶催化反应以SAM为甲基化供体，反应结束后SAM被转化为SAH，又经Mtn-LuxS连续两步催化形成带有巯基的同型半胱氨酸，基于巯基检测试剂与巯基化合物带有巯基的同型半胱氨酸的特征显色反应，测定体系的吸光度值，基于吸光值的高低筛选甲基转移酶突变体；
4.根据权利要求3所述的高通量筛选方法，其特征在于：重组质粒中还含有MetK、Mtn、LuxS基因片段，腺苷甲硫氨酸合成酶基因催化甲硫氨酸和ATP反应生成SAM，作为甲基化供体使用，催化底物进行甲基化反应反应结束后SAM被转化为SAH，又经Mtn-LuxS连续两步催化形成带有巯基的同型半胱氨酸；
5.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于：步骤(a)中活化、培养使用的多孔板为24孔板、48孔板、96孔板或384孔板；
6.权利要求1所述的甲基转移酶突变体高通量筛选方法在以N-乙酰5-羟基
7.一种甲基转移酶突变体，其特征在于：为以下任一项所示的氨基酸序列：
8.根据权利要求7所述的甲基转移酶突变体，其特征在于：128位的突变是突变为亮氨酸，160位的突变是突变为丝氨酸或缬氨酸，321位的突变是突变为亮氨酸，322位的突变是突变为亮氨酸或苯丙氨酸，324位的突变是突变为天冬氨酸。
9.编码权利要求7所述的甲基转移酶突变体的基因。
10.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求9所述的编码甲基转移酶突变体的基因，能够表达甲基转移酶突变体。
11.一种重组基因工程菌，所述重组基因工程菌中包含权利要求10所述的表达载体或其基因组中整合有权利要求9所述的编码甲基转移酶突变体的基因。
12.权利要求7所述的甲基转移酶突变体或权利要求10所述的表达载体或权利要求11所述的重组基因工程菌在生产N乙酰-5-甲氧基色胺中的应用，将基因工程菌诱导蛋白表达，然后离心收集细胞，再加入到含有底物N乙酰-5-羟基色胺的转化液中反应，最后从转化液中分离得到N乙酰-5-甲氧基色胺。
...【技术特征摘要】
1.一种甲基转移酶突变体的高通量筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于：甲基转移酶催化反应以sam为甲基化供体，反应结束后sam被转化为sah，又经mtn-luxs连续两步催化形成带有巯基的同型半胱氨酸，基于巯基检测试剂与巯基化合物带有巯基的同型半胱氨酸的特征显色反应，测定体系的吸光度值，基于吸光值的高低筛选甲基转移酶突变体；
4.根据权利要求3所述的高通量筛选方法，其特征在于：重组质粒中还含有metk、mtn、luxs基因片段，腺苷甲硫氨酸合成酶基因催化甲硫氨酸和atp反应生成sam，作为甲基化供体使用，催化底物进行甲基化反应反应结束后sam被转化为sah，又经mtn-luxs连续两步催化形成带有巯基的同型半胱氨酸；
5.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于：步骤(a)中活化、培养使用的多孔板为24孔板、48孔板、96孔板或384孔板；
6.权利要求1所述的甲基转移酶突变体高通量筛选方法在以n-乙酰5-羟基色胺为底物甲基转移酶催化...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴元庆，杨志彬，冯斌，李儒松，胡江林，
申请(专利权)人：河北维达康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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